MICROSCOPIC AND MOLECULAR STUDY OF BABESIA SPP. BABESIA BOVIS AND BABESIA BIGEMINA IN MOSUL CITY-IRAQ

Assiut University web-site: www.aun.edu.eg

MICROSCOPIC AND MOLECULAR STUDY OF BABESIA SPP. BABESIA BOVIS AND BABESIA BIGEMINA IN MOSUL CITY-IRAQ

E.G. SULEIMAN AND A.F.ALTAEE

Department of Microbiology, College of Veterinary Medicine, University of Mosul,

Mosul-Iraq

Received:26 July 2020;         Accepted: 25 August 2020

دراسة مجهرية جزيئية لطفيلي Babesia spp و Babesia bovis و Babesia bigemina في الابقار في مدينة الموصل – العراق

ايمان غانم سليمان  ، احلام فتحي الطائي

فرع الاحياء المجهرية – کلية الطب البيطري – جامعة الموصل – الموصل – العراق

Email: ahlaam.altaee@gmail.com      Assiut University web-site: www.aun.edu.eg

تضمنت الدراسة الحالية فحص 50 عينة دم جمعت من الابقار من کلا الجنسين ومن مختلف الاعمار ومن مناطق مختلفة في مدينة الموصل للمدة من بداية شهر تشرين الاول 2017 ولغاية نهاية شهر تشرين الثاني 2017 وذلک بکل من طريقة الفحص المجهري وتفاعل السلسلة المتبلر .

بلغت نسبة تشخيص طفيلي Babesia spp و Babesia bovis و Babesia bigemina بطريقة تفاعل السلسلة المتبمر 60% و 44% و 38% على التوالي وهي اعلى من النسبة التي سجلت بطريقة الفحص المجهري 44% و 32% و 32% على التوالي .

Corresponding author: A.F.ALTAEE

E-mail address: ahlaam.altaee@gmail.com

Present address: Department of microbiology, college of veterinary medicine, University of Mosul, Mosul-Iraq

ظهرت نتائج التضاعف على شکل حزم على هلام الاکاروز ترکيز 2% وبواقع ناتج تفاعل 644 و 350 و 278 زوجا قاعديا على التوالي . کما اشارت الدراسة ان اتباع الطرائق غير التجارية (البديلة) في استخلاص الـDNA من دم الابقار قد اثبتت کفاءتها في الاستخلاص والحصول على ترکيز وکمية مناسبة من الـDNA لاستخدامها في تقنية التفاعل التضاعفي (PCR) سلسلة الـ DNA اذ تعد من الطرائق السريعة والبسيطة والموثوقة لاستخلاص الـ DNA.

INTRODUCTION

المقدمــة

يعد مرض Babesiosis أو ما يسمى بداء الکمثرياتPiroplasmosis  أو حمى تکساس Texas fever  أو مرض الماء الاحمر Red water disease  أو حمى قراد الأبقارCattle tick fever واحدا من أهم الأمراض الطفيلية المنقولة بوساطة القراد الصلب وهو المسوؤل عن حدوث نسبة إصابات وهلاکات عالية في قطعان الأبقار في مختلف دول العالم (Bock et al.,2004). يسبب هذا المرض طفيلي يعود لجنس Babesia الذي يقع تحت شعبة Apicomplexa، صنف البوغيات Sporozoasida، رتبةPirplasmida  عائلة Babesiidae وان الأنواع الرئيسية التي تصيب الأبقار هي B.bovis وB.bigemina وB.divergens وB.major (OIE, 2013). يعد کل من B.bovis وB.bigemina من أکثر الأنواع امراضية وتأثيراً على صحة الأبقار وانتاجيتها (Chaudhry et al., 2010) وان هذان النوعان لهما انتشار واسع في مناطق مختلفة من العالم في المناطق الاستوائية وتحت الاستوائية ولاسيما في أسيا وأفريقيا ووسط وجنوب أمريکا واجزاء من جنوب اوروبا واسترالياHamsho et al., 2015) ) ويعد القراد نوع Rhipicephalus (Boophilus) microplus الذي يعود إلى عائلة Ixodidae الناقل الرئيس لهذين النوعين (Walker et al., 2003).

تختلف شدة امراضية طفيلي Babesia باختلاف أنواعه إذ يعد النوع B.bovis اکثر ضراوة من النوع  B.bigeminaعموماً فان کلا النوعين يسببان مرضا سريريا وان الابقار التي تشفى من الإصابة تبقى حاملة  للمرض وتصبح مصدرا رئيس لإصابة الابقار السليمة والمستعدة للاصابة . وتمتاز الأعراض السريرية في حالة الإصابة  بالمرض بالحمى العالية وفقر الدم والبيلة الهيموکلوبينية والترنح وقد يحدث الإجهاض في الأبقار الحوامل واختزال الخصوبة في الذکور خاصة الثيران(Zulfiqar et al., 2012, Bhata et al., 2017) بشکل عام يشکل مرض Babesiosis  اهمية کبيرة من بين الامراض الطفيلية في الأبقار وذلک بسبب تأثيره المباشر على الناحية الاقتصادية والانتاجية للابقار .تشخص الإصابة بطفيلي Babesia spp. بالاعتماد على العلامات السريرية وتاريخ المنطقة المرضي وانتشار القراد ويشخص الطفيلي مختبريا وذلک بعمل مسحات دموية خفيفة وثخينة وصبغها بصبغة الکيمزا ويعد هذا  الفحص هو الفحص الذهبي والقياسي والسريع والروتيني ولاسيما في الإصابات الحادة ولکن ليس في الإصابات تحت السريرية والتي تکون فيها نسبة التطفل واطئة (Terkawi et al., 2011, Demessie and Derso, 2015). وهناک طرائق اکثر دقة في تشخيص الإصابة بطفيلي Babesia spp عندما يکون مستوى التطفل واطئاً جداً في الدم مثل التقنيات الجزيئيةMolecular Techniques ومنها تفاعل السلسلة المتبلمر Polymerase Chain Reaction(PCR) التي وصفت في تشخيصDNA  للطفيلي في الأبقار الحاملة للإصابة وتحديد انواع Babesia في دم الحيوان وفي المراحل التطورية للطفيلي في القراد الناقل (Martins et al., 2010).

استخدمت تقنية التفاعل التضاعفي لسلسة الـ DNA في تشخيص طفيليات Babesia وأشارت العديد من الدراسات والأبحاث إن تقنية التفاعل التضاعفي لسلسلة الـDNA تمتلک حساسية وخصوصية عاليـة في التشخيص لطفيلـي Babesia spp في دم المضـيف الفقري والقراد الناقل وإن هذه التقنية لهـا القدرة على تحـديـد الطفيلـي حتى في مستـوى التطفـل القليـل جداً وکذلک تحديد الحيوانات الحاملة للإصابـة التي تشکـل مصادر خازنة لإصابة الجهـاز الهضمـي للقـراد

Figueroa, et al., 1992, Fahrimal, et al., 1992, Figueroa, et al., 1993, Smeenk, et al., 2000, Oliveria, et al., 2005 وأشار (Figuero, et al., 1992) في دراسته إلى إن اختبار  PCRيکون حساساً في تحديد إصابة الأبقار الکامنة بطفيلي B.bigemina .ذکر کل من (Fahrimal, et al.,1992) و(Calder et al., 1996) و(Caccio, et al., 2000) إن البادئات المستخدمة في تشخيص B.bovis تضخم من التسلسلات الجينية لکل من الجينات apocytochrome b و small subunit r RNA و B.tubulin وأشار (Calder et al., 1996) بأن التضخيم من منطقة الجين mitochondrial apocytochrome b قد أظهر حساسية عالية من التضخيم من الجين SS r RNA لـ B.bovis کما إن البادئ المصمم من apocyto chrome b لا يظهر تفاعلاً مع الـDNA للمضيف وذلک عند تحديد الـDNA لـ B.bovis وعند استخدام البادئ المصمم من الجين B.tubulin لوحظ إنه يحتاج إلى إجراء طريقة nested PCR وذلک لتمييزه عن قطع الـDNA للمضيف (Caccio et al., 2000). ونظرا لقلة الدراسات حول مدى الاصابة بطفيليB.bovis  وB.bigemina  في الابقار في مدينة الموصل ولعدم وجود دراسات حول استخدام تقنية تفاعل السلسلة المتبلمر في تشخيص الاصابة بطفيلي Babesia spp  اجريت هذه الدراسة.

MATERIALS AND METHODS

المواد وطرائق العمل

جمعت 50 عينة دم ابقار وذلک من الحالات المرضية الواردة إلى المستشفى التعليمي لکلية الطب البيطري وکذلک من الحقول التابعة لمنطقة کوکجلي وذلک للمدة من بداية شهر تشرين الأول 2017 ولغاية نهاية شهر تشرين الثاني 2017. وقد جمعت عينات الدم من کلا الجنسين ومن مختلف الأعمار ومن حيوانات تعاني من علامات سريرية مميزة لداء Babesiosis  ومن حيوانات تبدو سليمة سريرياً.

أخذت نماذج الدم بمقدار 3-5 مل من الوريد الوداجي بعد تعقيم المنطقة بالکحول الأثيلي 70% باستعمال محاقن طبية نبيذة ومعقمة وحفظت عينات الدم في انابيب تحتوي على مانع تخثر نوع K₃EDTA (5.4mg) وحُرکت قليلا لمنع حدوث تخثر للدم وسجلت البيانات الخاصة بکل عينة في استمارة خاصة تتضمن عمر وجنس الحيوان وتاريخ الجمع والمنطقة وهل الحيوان يعاني من علامات سريرية.

وحضرت مسحات دموية خفيفة وثبتت بالکحول المثيلي المطلق لمدة 2-3 دقائق وبعدها صبغت هذه المسحات بصبغة  May GrunwaldGiemsaوفقا لعدة صبغة جاهزة (London).

التقنيات الجزيئية التي اجريت على عينات الدم وذلک للکشف عن الاصابة بطفيلي Babesia spp والنوعين B.bovis و B.bigemina

1- استخلاص الحامض النووي الرايبوزي منقوص الاوکسجين DNA  من دم الأبقار

تم عزل الدنا من 50 عينة دم الابقـار وذلک بالاعتماد على الطريقـة المحـورة اليدويـة من قبـل

(Iranpur and Esmailizadeh, 2010).

2- قياس ترکيز ونقاوة الحامض النووي الرايبوزي منقوص الأوکسجين

باستخدام جهاز Biodrop التابع لکلية العلوم /جامعة الموصل/قسم علوم الحياة في مختبر البحوث الجزيئية وذلک بإضافة1مايکروليتر من الحامض النووي DNA  المستخلص من العينات في الحفرة المخصصة للجهاز وسجل ترکيز الحامض النووي المستخلص من عينات الدم ونقاوتهA₂₆₀nm /A₂₈₀nm Viljoen et al., 2005)).

3- فحص الـDNA على هلام الاکاروز

أجريت عملية الترحيل الکهربائي لعينات الـDNA  المستخلصة من الدم على هلام الاکاروز وفقا لـ(Sambrook etal,1989)وذلک باستخدام 2% من الاکاروز لترحيل DNA .

4- ضبط ترکيز DNA في العينات المدروسة کافة بالتخفيف بوساطة محلول TE

للحصول على الترکيز المطلوب لإجراء تفاعلات الـPCR  وکان (25) نانوغرام / مايکروليتر لکل عينة وذلک وفقا للمعادلة:  

C₁˟V₁=C₂˟V₂ 

5- التفاعل التضاعفي لسلسلة DNA والمستخلص من الدم والخاصة بجنس Babesia spp والنوعين B.bovis وB.bigemina

1-   تحضير البادئاتPrimers  المستخدمة في التفاعل :البادئات مجهزة من قبل شرکة Bioneer الکورية وکما موضح في الجدول(1).

الجدول 1:  يوضح البادئات مجهزة من قبل شرکة Bioneer الکورية.

2- تحضير خليط التفاعل

أ‌-      حضر خليط التفاعل التضاعفي لسلسلة  DNAوفقا للجدول(2):

جدول 2: يوضح خليط التفاعل التضاعفي لسلسلة  DNA

عينة السيطرة الموجبة: عينةDNA  مستخلصة من دم  لحالات مرضية حادة جدا وذات نسبة تطفل عالٍ لکل من B.bovis وB.bigemina  بلغت 17.6% و30.2% على التوالي.

عينة السيطرة السالبة : تحتوي انبوبةPCR على کل خليط التفاعل ماعدا DNA المستخلص من دم الأبقار.

ب‌-      مزجت جميع الانابيب بجهازMicrofuge  على سرعة عالية لمدة 3-5 ثوانٍ لإتمام مزج مکونات التفاعل ويجب مراعاة وضع الانابيب داخل الثلج أثناء العمل.

ت‌-      ادخلت أنابيب التفاعل في جهاز المبلمر الحراري Thermocycler لإجراء التفاعل التضاعفي باستخدام البرنامج الخاص لکل تفاعل والمخططات التالية توضح البرنامج الخاص لکل نوع من البادئات المستخدمة في هذه الدراسة :

1-      برنامـج التفاعل الرئيـس الخـاص بجـنس Babesia spp وذلـک باستـخـدام البـادئ المـصمـم بالاعتـمـاد (Figueroa et al., 1992)  جدول (3).

جدول 3: يوضح برنامج التفاعل الرئيس الخاص  بجنس Babesiaspp

2-      برنـامـج الـتفـاعل الرئـيس للـنـوع B.bovis وذلـک باستـخـدام البـادئ المصـمـم بالاعتـمـاد

(Figueroa et al.,1993) (جدول4).

جدول 4: يوضح برنامج التفاعل الرئيس للنوع B.bovis

3- برنامـج التفـاعـل الرئيـس الخـاص بالنـوع  B.bigemina وذلـک باستخـدام البـادئ المـصـمـم بالاعتـمـاد  (Figueroa et al.,1992)  (جدول 5).

جدول :5يوضح برنامج التفاعل الرئيس الخاص  بالنوع B.bigemina

4- بعد انتهاء التفاعل رفعت الأنابيب من جهاز المبلمر الحراري ثم سحب 5 مايکروليتر من کل  انبوبة PCR وحملت في هلام الاکاروز 2% المحضر مسبقا مع الدليل الحجمي DNALadder .

5- رحلت العينات وذلک بتشغيل جهاز الترحيل الکهربائي Electrophoresis  على فولتية 50 ولمدة ساعة وذلک للتأکد من نجاح عملية التضاعف.

6- وضع هلام الاکاروز في حوض يحتوي ماء مقطر مع بضعة قطرات من صبغة ايثيديوم بروميد وبکمية (300 مل) ماء مقطر مع 8قطرات من ايثيديوم بروميد ولمدة 30 دقيقة وذلک لصبغ الحزم في حالة وجودها.

7- وضع الهلام في جهاز الاشعة فوق البنفسجية لمشاهدة الحزم المصبوغة وملاحظة حزم نواتج التضخيم وصورت  بالکاميرا الرقمية .

1-   قُدرت الاحجام الجزيئية للقطع المتضاعفة اعتمادا على موقع الحزم إذ قدرت بالمقارنة مع حزم الدليل الحجمي DNA Ladder .

RESULTS

النتـائـج

تبين من الدراسة الحالية وجود جنس Babesia spp بشکل عام والنوعين B.bovis وB.bigemina بشکل خاص في مدينة الموصل وذلک من خلال تشخيصها مجهريا وجينيا ولقد سجلت تقنيةPCR  نسبة تشخيص أعلى لجنس Babesia بشکل عام والنوعين B.bovis وB.bigemina مما سُجل في الفحص المجهري لمسحات الدم المصبوغة بالکيمزا وبلغت (60% و44% و38%) على التوالي إذ تم تشخيص 8 عينات کانت سالبة الإصابة بجنس Babesia و6 عينات ظهرت سالبة الإصابة بالنوع B.bovis و3 عينات ظهرت سالبة الإصابة بالنوع B.bigemina وذلک بالفحص المجهري وکما موضح في الجدول (6)  .

جدول 6: يوضح عدد ونسب الاصابة بجنس Babesia spp والنوعين B.bovis وB.bigemina في 50عينة دم ابقار بکل من الفحص المجهري باستخدام صبغة الکيمزا وتقنية تفاعل البلمرة المتسلسل.

الاحرف المتشابهة تعني عدم وجود فرق معنوي وذلک عند مستوى معنوية P<0.05

تبين من خلال فحص المسحات الدموية الخفيفة والمصبوغة بصبغة بصبغةMay GrunwaldGiemsa stain  بتشخيص الإصابة بکل من طفيلي B.bovis وB.bigamina وذلک باستخدام العدسة الشيئية الزيتيةOil objective lens للمجهر الضوئي تحت قوة X100 ولقد تم تحضير مکررين من کل مسحة دموية وفحص 20-50 حقل مجهري لکل مسحة دموية لکي يُقرر هل ان الحيوان مصاب بالاوالي الدموية ام لا ولکن عند هذه القوة من تکبير المجهر کانت هناک سهولة في تمييز النوع.

شُخص B.bigemina بشکل مزدوج أو منفرد ومصطبغاً باللون الأزرق أو البنفسجي بشکل واضح جدا داخل الکريات الحمراء مع وضوح الکتلة النووية في کل جانب ويتراوح قياسه من 3- 5 مايکرون وکما موضح في الصورة وأيضا تميزت الاشکال الاخرى لهذا الطفيلي بسهولة وکما موضح في الصورة (1).

وأما ما يخص النوع B.bovis فلقد شُخص ايضا بقوة العدسة الزيتية الشيئية للمجهر الضوئي X100 وهو طفيلي صغير الحجم کمثري الشکل يتراوح حجمه من 0.5-2.5 مايکرون وظهر بشکل مزدوج مشکلا بذلک زاوية منفرجة وله کتلة نووية واحدة کما في الصورة (2).    

توضح الصورة (3) حزم الحامض النووي الرايبوزي منقوص الأوکسجين الذي استخلص من50  عينة  دم أبقار من کلا الجنسين ومن مختلف الأعمار وبترکيز 25نانوغرام / مايکروليتر في استخلاص الـDNA من الدم. تراوح ترکيزDNA  المستخلص من 28.0-355.7 نانوغرام / ماکروليتر وإن نقاوة الـDNA المستخلص تراوحت بين 1.2-1.9 .

صورة (3) يبين حزم الـDNA  الذي تم استخلاصه من دم الأبقار وترحيله على هلام الاکاروزترکيز 2%

استخدم البادئ الخاص بالکشف عن جنسBabesia بشکل عام (Babesia common) والمصمم بالاعتماد على (Figueroa et al.,1992). اذ أظهرت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام هذا البادئ إمکانية تشخيص جنسBabesia spp في عيناتDNA  المستخلصة والمستخدمة في هذا التفاعل  وکما موضح في الجدول )6) اذ ظهرت نتائج التضاعف على شکل حزم على هلام الاکاروز ترکيز 2% وبواقع ناتج تفاعل 644 زوجا قاعديا (Base pair (bp)) وکما موضح في الصورة (4) .

صورة (4) تبين ناتج تفاعل الـPCR  الخاص بجنس  Babesia باستخدام البادئ الخاص بجنس Babesia بشکل عام  إذ إن M تمثل الدليل الحجمي وp  مجموعة السيطرة الموجبة وN مجموعة السيطرة السالبة والعينات (1-12) تمثل ناتج التفاعل بحجم 644bpالتي رُحلت في هلام الاکاروز بترکيز 2%.

وأستخدم زوج البادئ الخاص بالکشف جينيا عن النوع B.bovis والخاص بالنوع B.bovis .
اذ أظهرت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام هذا البادئ امکانية تشخيص النوع B.bovis في  عينات  DNA المستخلصة إذ ظهرت نتائج التضخيم على هلام الاکاروز ترکيز 2% على شکل حزم نتيجة وجود المواقع المکملة لها في جين النوع B.bovis  وبواقع ناتج تفاعل 350 bp وکما موضح في الصورة (5)

صورة (5) تبين ناتج تفاعل الـPCR  الخاص بالنوع Babesia bovis باستخدام البادئ الخاصBabesia bovis إذ إن M تمثل الدليل الحجمي  وP مجموعة السيطرة الموجبة وN مجموعة السيطرة السالبة والعينات (1-5 و8-10 موجبة وعينة 7 سالبة ) تمثل ناتج التفاعل بحجم 350bp التي رُحلت في هلام الاکاروز بترکيز 2%

واسـتـخـدم زوج البــادئ الخـاص بالکـشــف جـيـنـيـا عـلـى الـنـوع    B. bigeminaوالمصـمـم بالاعتـمـاد عـلـى ((Figueroa et al., 1992.

اذ أظهرت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام هذا البادئ امکانية تشخيص النوع B. bigemina في عينات الـDNA إذ إن هذا البادئ أظهر نتائج تضاعف على هلام الاکاروز ترکيز2% وعلى شکل حزم نتيجة وجود المواقع المکملة لها في جين النوع B.bigemina وبواقع ناتج تفاعل 278bp وکما موضح في الصورة (6).

صورة (6) تبين ناتج تفاعل الـPCR  الخاص بالنوع Babesia bigemina باستخدام البادئ الخاص  Babesia bigemina إذ إن M تمثل الدليل الحجمي وP مجموعة السيطرة الموجبة وN مجموعة السيطرة السالبة والعينات (1-7 و9 موجبة الاصابة وعينة 8 سالبة الإصابة) تمثل ناتج التفاعل بحجم 278bp التي رُحلت في هلام الاکاروز بترکيز 2%

DISCUSSION

المناقشـة

اتفقت نتيجة هذه الدراسة مع دراسة (El-Fayomy et al., 2013) و (Shams et al., 2013) بان النتائج المتحصل عليها مـن الفحـص المجهري تختلـف قليـلا عـن التي حُصل عليها بـPCR  وهـذا يعـود إلى الحساسية العالية لهـذه الـتقـنيـة في التشخيص وهـي ملائمة فـي تشخيـص مـدى واسـع من الممـرضات أوالعـينـات الصغيـرة الحجـم وذکـر(Chaudhry et al.,2010) إن تقنيةPCR  أکثر حساسية وخصوصية لتحديد مستوى الإصابة الواطئة في الحيوانات الحاملة إذا ما قورنت مع الفحص المجهري إذ استخدم بادئات مشتقة من جينSmall Subunit ribosomal RNA  ولقد سجل إصابة بکل من B.bovisوB.bigemina 11% و18% على التوالي وذلک من مجموع 100 عينة جمعت بشکل عشوائي من حيوانات تبدو سليمة سريريا أو حاملة للإصابة .

واتفقت نتيجة هذه الدراسة أيضا مع کل من (Hussian et al., 2017) في باکستان و(Hossary, 2016) في مصر في تشخيص  نسبة إصابة أعلى بطفيلي B.bovis بتقنية PCR  من الفحص المجهري في سلالات الأبقار المحلية والهجينة وذلک باستخدام بادئات مصممة بالاعتماد على کل من (Zulfiqar et al., 2012) و(Figueroa et al.,1993)، وأما في العراق فذکر(Sabber and Aaiz, 2016) في محافظة القادسية أن تحديد تکرار الإصابة بـ PCR, وnPCR يسمح بتشخيص Babesia خلال مراحل الإصابة الأولى وفي الحالات غير الظاهر عليها علامات المرض وهي تقنية مهمة جدا في الدراسات الوبائية ولاسيما وأن الحيوانات الحاملة للمرض تمثل مصدراً رئيساً لإصابة إناث قراد Boophilus microplus إذ سُجلت نسبة إصابة کلية بجنس Babesia spp والنوعين  B.bovis وB.bigemina وذلک بطريقة تفاعل السلسلة المتبلمرة في الوقت الحقيقي بلغت 43.22%(83/192) و55.42%(47/83) و44.57%(37/83 ) على التوالي.

يمثل صبغ المسحات الدموية الخفيفة او السميکة بصبغة الکيمزا الفحص الذهبي والقياسي في تشخيص Babesia spp في مختلف دول العالم (Garnham,1980) إذ يتم تشخيصها بقوة تکبير العدسة الزيتية X100 وهي قوة کافية لتمييز نوع Babesia الصغيرة الحجم المتمثلة بالنوع B.bovis (0.5-2.5 مايکرون) والکبيرة الحجم المتمثلة بالنوع B.bigemina (3-5 مايکرون) مع تحديد مواصفاتها الشکلية والقياسية وبيان موقعها داخل الکريات الحمر، ونظرا لکون هذه التقنية تحتاج إلى وقت غير محدد في الفحص المجهري والمهارة والدقة في الفحص والترشيح المستمر للصبغة للتأکد من خلوها من ترسبات الصبغة لغرض تقليل نسبة الخطأ (Thrall et al.,2004) فضلاً عن هذا فإن هذه التقنية تکون قليلة الحساسية low sensitivity ولاسيما في الحالات تحت السريرية Subclinical cases والحالات المزمنة Chronic phase والتي تمتاز بنسب تطفل واطئة جدا  مما يجعلها مصدرا خطرا لاصابة القراد ومن ثم انتقال المرض للابقار (Wongsrichanalai et al.,1991) ولقد ذکر (DeVos and Potgieter, 1994) إن التمييز بين B.bovis و     B.bigemina ليس سهلا ومن المستحيل تشخيص نوع الطفيلي من خلال معرفة التاريخ المرضي والعلامات السريرية والفحص العياني والفحص المجهري لمسحات الدم المصبوغة بالکيمزا فقط يستطيع التمييز بين الانواع ولکن اختلافات القياسات وأحيانا يجعل عملية التفريق تبدو صعبة ومتداخلة ، لذا ظهرت التقنيات البايولوجية الجزيئية في السنوات الاخيرة  وفتحت آفاقا واسعة في تشخيص الإصابات الطفيلية إذ تسمح هذه التقنية بتضخيم أجزاء صغيرة من الـDNA  خارج جسم الکائن الحي وبذلک قدمت هذه التقنية إمکانيات کبيرة ودقيقة لتشخيص الممرضات ومنها الطفيليات فهي عبارة عن تقنية خارج خلوية تستعمل لنسخ أوتضخيم تتابع محدد من الـDNA  إذ تسمح بتضخيم قطعة الـDNA  صغيرة ملايين المرات (Al-Ibrahimi, 2008).

تعد عملية استخلاص وتنقية الحامض النووي الـDNA  من مصادره هي أول الخطوات الرئيسة في تقانات البايولوجية الجزيئية ومنها التفاعل التضاعفي لسلسلةDNA  (PCR) وهناک صعوبات وعوامل تواجه الباحث وتؤثر على ترکيزالـDNA  المستخلص ونقاوته ومنها: حصول التلوث وفعالية الأنزيمات المحللة للاحماض النووية ودرجة الخبرة والتدريب في استخلاص الحامض النووي (Salah, 2014). واتفقت نتيجة استخلاص الـ DNA من دم الأبقار مع ماذکره (Al-Hassani, 2013) بان اتباع طريقة استخلاص الـDNA اليدوية المحورة قد أثبتت کفاءتها في الاستخلاص والحصول على ترکيز وکمية مناسبة من الـDNA  لاستعمالها في تقنية  التفاعل التضاعفي (PCR) لسلسلة الـDNA  إذ امتازت هذه الطريقة بقلة کلفتها فضلاً عن توفر المواد الکيمياوية والأجهزة المستعملة في عملية الاستخلاص فضلاً عن انها تستغرق وقتا قصيرا وانالـDNA المستخلص من الممکن حفظه لمدة طويلة بدرجة- 20م°.

اتفقت نتيجة هذه الدراسة فيما يخص تشخيص Babesia spp بشکل عام باستخدام زوج البادئات المصمم بالاعتتمـاد عـلى  (Figueroa et al.,1992) الـذي أعـطـى ناتـج تفاعـل بواقـع 644 bp مـع دراسـة (Ibrahim et al., 2009) الذي سجل نسبة إصابة بجنس Babesia بشکل عام وباستخدام زوج البادئات نفسه بلغت 26% وإن تقنيةPCR  کانت معنويا أعلى وأکثر کفاءة في تشخيص الکمثريات من الفحص المجهري. ذکر(Mahmmod, 2012) إنَّ زوج البادئ المستخدم لتشخيص جنس Babesia والمشتق من جينSmall Subunit ribosomal RNA  الذي استخدم في تضخيم وتحديد الـDNA  لجنس Babesia لايستطيع التفـريـق بيـن انـواع Babesia، ايضا اتفـقت نتيجة هـذه الدراسة مـع دراسـة (El-Fayomy et al., 2013) إذ سجل نسبة إصابة بجنس Babesia spp بتقنيةPCR والفحص المجهري بلغت 23% و13% وذلک من مجموع 52 عينة دم اختيرت من بين 123 عينة دم أبقار مريضة في بورسعيد في مصر واتفقت نتيجة هذه الدراسة مع دراسة (Chaudhry et al., 2010) في تشخيصه نسبة إصابة کلية بجنس Babesia باستخدام  PCR  والفحص المجهري 29% و18% على التوالي وذلک بالاعتماد البادئات المشتقة من جين Small Subunit ribosomal RNA  وأشارت دراسة (Khamesipour et al., 2015) في إيران بأن تقنيةPCR  حساسة جدا في تشخيص الـDNA  لطفيلي Babesia في عينات الدم للحيوانات التي جمعت بشکل عشوائي لکل من الماشية 7.1%
(n=100) والجمال 6.56% (n =122) في حين لم يشخص جنس Babesia في الأغنام (0.00%(n=95) ولقد عُدَّت نتائج الفحص موجبة عند ظهور الحزم بواقع 428bp  لقطعة جين Small 18S RNA  .

واتفقت نتيجة هذه الدراسة مع دراسة (Figueroa et al.,1992) بان زوج البادئ ذا الوزن الجزيئي 278 bp يستطيع تحديد الکميات القليلة جدا من قطعDNA  للطفيلي وإنه متخصص فقط للنوع B.bigemina وليس لتشخيصDNA  لطفيلي B.bovis وAnaplasma marginale أو ستة انواع من البکتريا أو کريات الدم البيض وان ناتجPCR  من الممکن تحديده في عينات الـDNA  المستخلص من 200 مايکروليتر من الدم مع نسبة تطفل واطئة جدا (اقل من 1في 10⁸) التي تحسب بـ30 کرية دم حمراء مصابة بالطفيلي .

REFERENCES

المراجـع

Al-Hassani, O.M.H. (2013): Determining the genetic variability of GALT gene in newborn. PhD. Thesis, University of Mosul, College of science, Mosul, Iraq, pp58 (In Arabic).

Al-Ibrahimi, A.K.K. (2008): Trichomoniasis studies in Basrah Province. Msc. Thesis, University of Basrah , College of Education Basrah, Iraq, pp67-68 (In Arabic).

Bhata, S.A.; Singha, N.K.; Singh, H.A.; Ratha, S.S. (2017): Molecular prevalence of Babesia bigemina in Rhipicephalus microplus ticks infesting cross-bred cattle of Punjab, India. Parasite Epidemiology and Control, 2: 85–90.

Bock, R.; Jackson, L.; Devos, A.; Jorgensen, W. (2004): Babesiosis of Cattle. Parasitology, 129: 247-269.

Caccio, S.; Camma, C.; Onuma, M. and Severini (2000): The b-tubulin gene of Babesia and Theileria parasites in an informative marker for species discrimination. International Journal for Parasitology, 3: 1181-5.

 Calder, J.A.M.; Reddy, G.R.; Chieves, L.; Courtney, C.H.; Littell, R.; Livengood, R.; Norval, R.A.I.; Smith, C. and Dame, J.B. (1996):  Monitoring Babesia bovis infections in cattle by using PCR-Based tests. Journal of Clinical Microbiology, 2748-2755.

Chaudhry, Z.I.; Suleman, M.; Younus, and Aslim, A. (2010): Molecular detection of Babesia bigemina and Babesia bovis in Crossbred carrier cattle through PCR. Pakistan J Zool, 422: 201-204.

Demessie, Y. and Derso, S. (2015): Ticks borne hemoparasitic diseases of ruminants: A Review. Advances in Biological Research, 94: 210-224.

DeVos, AJ.; Potgieter, F.T. (1994): Bovine babesiosis in infections diseases of livestock Ed. Getzer JAW., Thomoson GR., Tustin RC..pp. 278-294. Capetown. Oxford University Press.

El- Fayomy, A.O.; Ghoneim, A.M.; Abu-Samak, O.A. and Khidr, A.A. (2013): Contribution of Babesia to the Illness of cows in Port Said Governorates, Egypt. Global Veterinaria, 111: 118-122.

Fahrimal, Y.; Goff, W.L. and Jasmer, P. (1992): Detection of Babesia bovis carrier cattle by using polymerase chain reaction amplification of parasite DNA. Journal of Clinical Microbiology, 306: 1374-1379.

Figueroa, J.V.; Chieves, L.P.; Johnson, GS. and Buening, GM. (1993): Muttiplex polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood.. Vet. Parasitol, 50: 69-81.

Figueroa, J.V.; Chieves, L.P.; Johnson, G.S. and Bening, G.M. (1992): Detection of Babesia bigemina – infected carriers cattle by polymerase chain reaction amplification. J. Clin. Microbiol, 90: 2576-2582.

Garnham, P.C.C. (1980): Human babesiosis: European aspects. Transactions of the royal society of tropical medicine and hygiene. 74: 153-155.

Hamsho, A.; Tesfamarym, G.; Megersa, G. and Megersa, M.A. (2015): Cross – Sectional of Bovine babesiosis in Teltele district, Borena, zone, Southern Ethiopia. Veterinary science and Technology , 63 http://dx.doi.org/10.4172-2157-7579.1000230.

Hossary, A.A.T. (2016): Comparism between conventional and molecular methods for diagnosis of bovine babesiosis Babesia bovis infection in ticks infested cattle in upper Egypt .J Parasite Dis, 2016, DOI 10.1007 /s12639-016-0785-.

Hussain, S.; Ashraf, K.A.N.W.A.RN.; Jamal, M.A.; Naeem, H.; Ahmad, N. and Rahman, A.U. (2017): Diagnosis of Babesia infection in Iindigenous and crossbred cattle with comparison between conventional and molecular diagnostic techniques. Journal of Infection and Molecular Biology, 511-6.

Ibrahim, A.K.; El Behairy, A.M.; Mahran, K.A.; Awad, W.S. (2009): Clinical and Laboratory diagnosis of piroplasmide in naturally infected cattle in Egypt. J Egypt Vet Med Assoc, 692: 105-203.

Iranpur, V. and Esmailizadeh, A. (2010): Rapid extraction of high quality of animal science, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, shahre kord, Iran www.protocol-online,org.

Khamesipour, F.; Doosti, A.; Koohi, A. and Chehelgerdi, M. (2015): Determination of the presence of Babesia DNA in blood samples of cattle ,camel and sheep in Iran by PCR. Arch Biol Sci Belgrade, 671: 83-90.

Mahmmod, Y.S. (2012): Molecular detection of natural Babesia bovis infection from clinically infected and apparently healthy water Buffaloes Bubalus bubalis and crossbred cattle. Journal of Buffalo Science, 1: 55-60.

Martins, T.M.; Neves, L.; Pedro, O.C.; Fafetine, J.M.; Dorsario, V.E. and Domingos, A. (2010): Molecular detection of Babesia spp. and other haemoparasitic infections of cattle in Maputo Prevince, Mozambique. Parasitology. P.1-8, Cambridge University Press., doi:10.1017/5003118200999/96x.

Oliveira, M.C.S.; Oliveira – Sequeira, T.C.G.; Amaraute, A.A.F.T. and Oliveira, H.N. (2005): Babesia spp infection in Boophilus microplus engorged females and eggs in Sao Paulo State Brazil. Vet Parasitol, 130, 61-67.

Sabber, K.H. and Aaiz N.N. (2016): Molecular detection of Babesia bovis in cattle in AL-Qadisiyah Province . Iraqi Journal of Veterinary Science, 402: 155-158.

Salah, S.I.D. (2014): Measuring the genetic dimension of the local chicken and its comparison with birds strains chicken meat and eggs. Ph.D Thesis, University of Mosul, College of Agriculture and Forestry, Mosul, Iraq, pp 96-97 (in Arabic).

 Sambrook, J.; Fritsh, E.F. and Manitis, T. (1989): Molecular cloning: A laboratory manual .2^nd Ed., cold spring harbor laboratory press, cold spring harbor, New York.

Shams, S.; Ayaz, S.; Ali, I.; Khan, S.; Gul, I.; Gul, N. and Khan, S.N. (2013): Sensitivity and specificity of PCR and. Microscopy in detection of Babesiosis in domesticated cattle of Khyber Pakhunkhwa, Pakistan. International Journal of Advancements in Research and Technology, 2: 37-41.

Smeenk, I.; Kelly, P.J.; Wray, K.; Musuka, G.; Trees, A.J. and Jongejan, F. (2000): Babesia bovis and Babesia bigemina DNA deected in cattle and ticks from Zimbabweby polymerase chain reaction. JIS. Afr. Vet. Ass, 711: 21-24.

Terkawi, M.A.; Huyen, N.X.;  Shinuo, C.; Impankaew, Maklon, K.;  Aboulaila, M.; Uno,  A.;  Goo, Y.K.; Yakoyama, N.; JiHapalapong, S.; Xuan, X. and Igarashi, I. (2011):  Molecular and Serological prevalence of Babesia bovis and Babesia bigemina in water buffaloes in the northeast region of Thailand. Veterinary parasitology, 178: 201-207. 10.

Thrall, M.A.; Baker, D.C.; Campbell, T.W.; Dewicola, D.; Feltman, M.; Lassen, E.D.; Rebar, A. and Weisern, G. (2004): Veterinary hematology and clinical chemistry. Lippincott Williams wilking. A welters Kluwer company.: 9-20.

Viljoen, G.J.; Louis, H. and Grawther, R. (2005): Molecular Diagnostic PCR. Handbook. 1^st ed. Springer. Dordrecht Netherlands, pp: 178-187.

Walker, A.; Bouattour, A.; Camicas, I.; Estrado Pena, A.; Horak, I.G.; Latif, A.A.; Pergram R.G. and Preston, P.M. (2003): Ticks of domestic animals in Africa. A guide to identification of species Bioscience Reports.  Comiston Drive, Edinburgh EH105QR., Scotland U.K.,.

Wongsrichanalai, C.; Pornsilapapatip, J.; Namsiripongpun, V.; Webster, H.K.; Luccini, A.; Pansamdang, P.; Wilde, H.; Prasti, H. and Suk, M. (1991):  Acridine orange fluorescent microscopy and the detection of malaria in population with low density parasitemia. American  Journal of Tropical medicine and Hygiene, 44: 17-20.

World organization for animal health (OIE)(2013):Bovine babesiosis. OIE Technical disease cards. Scientific.dept@oie.int.

Zulfiqar, S.; Shahnawaz, S.; Ali, M.; Bhuta, AM.; Iqbal, S.; Hyat, S.; Qadir, S.; Latif, M.;  Kiran, N.; Sad, A.;  Ali, M. and  Iqbal, F. (2012): Detection of Babesia bovis in blood samples and its effect on the hematological and serum biochemical profile in large ruminants from Southern Punjab. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 104-108.