SEROREVELATION OF ANTIBODIES OF EQUINE HERPESVIRUS (EHV1/EHV4) IN SYRIA

قسم أمراض الحيوان

کلية الطب البيطرى – جامعة البعث – حماه - سوريا

Serorevelation of Antibodies of Equine Herpesvirus (EHV1/EHV4) In Syria

(With One Table and Two Figures)

الکشف عن الأضداد النوعية للقوباء الخيلية النمطين المصليين

1 و 4 في سورية

حازم الطويل ، عبد الکريم قلب اللوز، محمد زهير الأحمد*

* قسم الجراحة والولادة – کلية الطب البيطرى – جامعة البعث – حماه - سوريا

(Received at 18/3/2011)

الهدف من هذه الدراسة هو التقصي المصلي عن مرض الإجهاض الوبائي عند الخيل في سورية أو ما يسمى بإلتهاب الأنف والرئة الفيروسي الخيلي أو إعتلال الدماغ والنخاع الشوکي الخيلي والمعروف عالمياً بالقـوباء الخيلية النمطين المصليين (EHV1 وEHV4 ). ينتشر هذا المرض بشکل کبير في کل بلدان العالم التي تعنى بتربية الخيول. يعتبر النمط المصلي EHV1 من الأمراض المجهضة للخيل کما أنه يسبب اضطرابات تنفسية وعصبية في حين أن النمط EHV4 يکون مسؤولاً عن الاضطرابات التنفسية. تم في هذه الدراسة التقصي مصلياً عن إصابة الخيول في سورية بأحد نمطي الفيروس المصليين (1 و 4) وذلک في عينات دموية جمعت من 203 خيول (حصان – فرس – مهر) غير ملقحة ضد المرض موزعة على خمس مناطق رئيسية لتشمل کامل سورية وذلک باستخدام إختبار المقايسة المناعية الأنزيمية غير المباشرة (الإليزا غير المباشرة). تم العثور على الأضداد الخاصة بالنمط EHV1 في المناطق الخمس بواقع 7(3.5%) عينات إيجابية مصلياً کما تم العثور على الأضداد الخاصة بالنمط EHV4 في المناطق الخمس بواقع 195(96%) عينة إيجابية مصلياً. وهذه أول دراسة للتقصي عن هذا المرض في سوريا.

SUMMARY

The objective of this study is, serological investigation of Epizootic Equine Abortion (EEA) or Equine Rhinopneumonitis (ER) Equine HerpesvirusMyeloencephalopathy(EHM) that know worldwide Equid herpesvirus (EHV type 1 and 4) in Syria. Equid herpesvirus 1 and 4 are widespread in the domestic horses population worldwide. EHV1 is a major cause of abortion, respiratory and neurologicaldisorders in horses. EHV4 is responsible of respiratory disease.In this study, Antibodies of EHV1 and 4 were investigated serologically in horses in Syria. A total of 203 unvaccinated horses in five regions in Syria were sampled and tested using indirect ELISA. EHV1-specific antibodies were found to be in fifth regions as 7(3.5%). EHV4- specific antibodies were found to be in fifth regions as 195(96%). This is the first serological investigation for EHV1 and EHV4 in Syria.

Key words: Epizootic equine abortion, equine herpesvirus, serology, Syria.

Introduction

المقدمــة

إن مرض التهاب الأنف والرئة المعدي أو مرض الإجهاض الوبائي الخيلي (القوباء الخيلية النمطين EHV-1 و EHV-4) هو من الأمراض الحموية الخطيرة التي تصيب الخيول کما يعد هذا المرض العامل الرئيسي لظهور التهابات رشحية للأغشية المخاطية في الرأس مصحوبة بأعراض التنفسية وکذلک إجهاض الإناث الحوامل والاضطرابات العصبية والحمى ويسبب حدوث الالتهاب الرئوي الولادي عند الأمهار ونفوقها وکذلک حدوث الاعتلال الدماغي الشوکي عند الخيول في کل أنحاء العالم. وقد تم إثبات وجود هذا المرض منذ أکثر من 60 عاماً کمهدد لتربية الخيول العالمية (O’Callaghan et al., 1983; Allen and Bryans, 1986 ; Bryans and allen, 1988; Allen et al., 1999;                                Crabb and Studdert, 1995)

حتى عام 1981 کان يعتقد أن النمطين المصليين للحمة يشکلان نمطاً مصلياً واحداً والذي کان يعرف بالنمط المصلي 1 ويعرف کمرض باسم (الإجهاض الحموي الوبائي أو التهاب الأنف والرئة المعدي عند الخيول) حيث وجدت قرابة مصلية شديدة جدا بين (EHV-1) و(EHV-4) والطرق المصلية العادية المتبعة في الکشف عن الأضداد لا تستطيع الکشف إلا عن الأضداد المصلية للنمطين معاً ولا يتم التفريق بينهما إلا بطرق متقدمة مثل تقنية (تفاعل البلمرة المتسلسل -PCR) فهما يمتلکان تتابـع متشابـه للنکليوتيدات حيث تصـل نسبـة التشابه من 55% إلى 84% وکـذلک تتابـع متشابـه للأحمـاض الأمينيـة يصل من 55% إلى 96%.(Telford et al., 1992 ; 1998) . لکن بينت نتيجة الفحوصات لتحديد البنية الداخلية النکليوزيدية للدنا أنهما حمتان مختلفتان مستضدياً ومورثياً وتنتميان إلى جنس الحمات الحماقية (Varicellovirus) التي تنتمي لتحت عائلة حمات القوباء ألفا (Alphaharpesvirina) (Studdert 1974; Sabine et al., 1981)         والتي بدورهـا تنتمـي إلـى عائلـة حمـات القوبـاء (Herpesviridae) (Carter and Wise,  2006).

ينتشر المرض في معظم دول العالم ويعد کمشکلة عالمية تهدد تربية الخيول في جميع أنحاء العالم(Matumoto et al., 1965) . وتأتي أهمية هذا المرض من الصفـة التي يمتلکها العامل المسبب من خلال مرحلة الکمـون التي تقـوم بها الحمـة داخل جسم الحيوان المصاب وعودة الأعراض بعد فترة من الشفاء .(Edington et al., 1994) يصيب المرض الخيول بالدرجة الأولى، ثم تأتي الحمير والبغال بالدرجة الثانية، بغض النظر عن العمر والجنس. ولکن لوحظ أن معظم الإصابات المبکرة تکون عند الخيول بعد إتمامها الشهر الثاني عشر من عمرها (Edington et al., 1994). وهناک دراسات تدل على انتشـار إصابات تنفسية کثيرة قبل سن الفطام عند الأمهار (Bryans, 1981)، کما بينت تقاريـر بحثيـة للتقصي عن المـرض في أستراليـا عن وجـود أجسـام مضادة للمـرض عند أمهـار مـن أمهـات غير محصنـة ضد المرض بعمر شهر واحد فقط .(Gilkerson et al., 1997)

ينتقل المرض عن طريق التماس المباشر بين الحيوانات المصابة والسليمة أو الحيوانات الحاملة للمرض. کما ينتقل عن طريق التماس غير المباشر بين الحيوانات المصابة أو الحاملة أو الناقهة والحيوانات غير المصابة وذلک عن طريق أدوات الحيوان والعلف والماء والتي تکون قد لوثت من قبل الحيوان المصاب. کما يمکن للعدوى أن تنتقل عن طريق أدوات الطبيب البيطري ، ينتقـل العامـل المسـبب أيضاً عن طريـق الإفـرازات الأنفيـة والفموية(Doll and Bryans, 1963; Allen and Bryans, 1986). کما تعتبر الأجنة المجهضة والسوائـل الجنينية الناتجة عـن إجهـاض الأفـراس المصابة بالمرض مصدراً خطيراً للعدوى Ballagi et al. 1990)).

وقد لوحظ أن العدوى الکامنة تعود للنشاط بعد تعرض الحيوان الذي يحمل الإصابة للإجهاد. والأفراس المصابـة بعـدوى کامنـة تکـون مصدراً لإصابـة جنينهـا بالمـرض وعندمـا يـولد هـذا المهـر يصبـح بـدوره مصـدراً للعـدوى Gilkerson et al., 1997)). کمـا أن الإجهـاد والعـلاج بالستيروئيدات القشرية يؤدي أيضـاً إلى تنشيـط الحمـة وعودة العدوى من جديد (Welch et al., 1992; Slater 2007).

کذلک تستطيع الذکور المصابـة أن تنقل العدوى أيضاً عن طريق الجمـاع حيث يتم طـرح الحمـة عن طريق السائل المنوي ولمدة طويلة. ووجد أيضاً أن الحمـة تتفاعل مع الکابسول الذي يوجد في البويضة الملقحة وبالتالي بقاء هذه الحمة في الجنيـن رغـم اضمحلال الکابسـول بعد 22- 25 يوماً بعد التلقيح (Betteridge et al., 1989; Carvalho et al., 2000).

من أهم الأعراض التي تظهر على الحيوان الحمى حيث تصل درجة الحرارة إلى 40 مﹾ (Allen and Bryans, 1986) والقهـم (فقـدان الشهيـة)  (Studdert, 1974)  مع أعراض تنفسية بعد فترة حضانة تمتد من 3- 6 أيام من التعرض لمصدر العدوى على شکل إفرازات أنفية مخاطية تتحول إلى قيحية نتيجة التهاب الأنف والرئة والتي تتطور نتيجة الإصابة الثانوية بالإضافة للسعال وزيادة الأصـوات التنفسيـة والإفـرازات العينيـة (Bryans and Allen, 1989). تحدث الإصابـة التنفسيـة بشکـل أکثـر تکراراً ومصادفـة لهذا المسبب في التجمعات التي تجرى للخيول بهدف التدريب والسباقات ومنافسات الفروسية الأخرى

(OIE Terrestrial Manual 2008) تکون الإصابة التنفسية ناتجة عن الإصابة بالنمط الفيروسي 4 عند الخيول بعمر فوق (2-3) سنة وتکون الأعراض متشابهة مع الإصابة التنفسية بالنمط 1(Edington et al., 1991) . تحدث الإصابة التنفسية بالنمط (EHV-1) في الخيول اليافعة تحت 2 سنة وفي الإناث الحوامل والإناث الضعيفة والذکور کبيرة العمر والضعيفة  . (Allen et al., 2004)إن الخطر التالي للإصابة التنفسية يکون من خلال إجهاض الإناث الحوامل والإصابات العصبية المرکزيةحيث يحدث الإجهاض بعد فترة حضانة تمتد من 7 أيام إلى عدة أشهر (Bryans and Allen, 1989).إن حمـة القوباء الخيليـة النمط 1 هي من أهم العوامل الممرضة واسعـة الانتشار من خلال إثارتها لعاصفـة من الإجهاضات أو الانتشـار الفردي عند الأفراس الحوامل وکذلک إحداث موت المواليد المبکر والإصـابات التنفسيـة في الخيـول الفتية وکذلک إحداثه للإعتلال الدماغي الشوکي

(Van Maanen, 2002; Reed and Toribio 2004; Patel and Heldens, 2005).

تجهض الأفراس الحوامل عادةً في الفترة بين 6 و 11 شهراً من الحمل حتى في حالة عـدم وجـود علامـات سريريـة أخـرى للمـرض وتحـدث 95% تقريباً من حالات الإجهـاض نتيجـة للإصابـة بالنمـط 1 في الثلث الأخيـر من الحمـل Allen and Bryans, 1986)). عندما تصاب الحوامل في الفترة الأخيرة من الحمل يلاحظ أنها تلد مواليد ميتة أو أمهار حية ضعيفة مصابة بالمرض تظهر عليها الأعراض فيما بعد وتنفق خلال ثلاثة أيام (Van Maanen et al., 2000).

يتم تشخيص المرض حقلياً عن طريق مشاهدة الأعراض والصفة التشريحية أما التشخيص المخبري فيتم من خلال الفحص النسيجي مع عزل الفيروس من الأعضاء المتضررة (الکبد-الجنين المجهض-العقد البلغمية). يستخدم اختبار الـ PCR (Polymerase Chaine Reaction) لتشخيص الإصابة من خلال إکثار الحمض النووي الفيروسي للنمطين 1/4 في العينات السريرية النسيجية حتى العينات المحفوظة بالبرافين أو المزروعة في الخلايا المعـدة لتکاثـر الفيـروس (Borchers and Slater, 1993) . أما التشخيص المصلي بطريقة الإليزا ELISA الکلاسيکية (Dutta et al., 1983) واختبار تثبيت المتممة CFT وإختبار التألق المناعي IFT (Thomson et al., 1976). وهذه الطرق الاعتيادية المصلية للکشف عن مرض الإجهاض الوبائي أو إلتهاب الأنف والرئة الخيلي لا تفرق بين الإصابة بالنمط المصلي 1 والنمط المصلي 4 بسبب التفاعل المستضدي المتصالب للنمطين(Crabb and Studdert, 1993; Crabb and Studdert 1995; Hartley et al., 2005). في أواسط التسعينات تم تطوير نوع خاص من الإليزا لتشخيص الإصابة بين النمطين 1 و 4 يعتمد على تقنية جديدة تعتمد على اختلاف الجزء الطرفي (سي) البروتيني من البروتين السکري (جي) لکلا النمطين(ELISA based on the C-terminal portion of glycoprotein G of both viruses)  تعـد الإليزا المطورة طريقـة يعتمـد عليـها ومفضلـة بسبب الفائدة التطبيقية لهـذا الإختبـار وحساسيتـه بالمقارنـة مع الاختبارات المصلية الأخرى.  (Crabb and Studdert, 1993; Crabb and Studdert et al., 1995; Yasunaga et al., 2000; Hartley et al., 2005).

Objectives

أهداف البحث

1 – تحديد وجود الحالات الإيجابية مصليا لمرض الإجهاض الوبائي عند الخيول والمعروف عالميا بالقوباء الخيلي (EHV-1 و EHV-4) في سورية.

2- تحديد نسبة هذه الحالات الإيجابية لتحديد انتشار المرض مصليا في المناطق المدروسة.

Materials and Methods

مـواد وطرائق العمل

شمل البحث دراسة ناديين من أندية الخيول وعدد من المزارع الخاصة التي تعنى بتربية الخيل وقد بلغ مجموعها 22 مزرعة وقد تم الحصول أيضا على عينات من مزارع خاصة لمربين هواة تحوي رأس أو رأسين من الخيل، وقد بلغ المجموع الکلي لعدد الحيوانات في هذه الأندية والمزارع 398 رأس خيل، حيث أخذت عينات دم باستخدام أنابيب مفرغة من الهواء، وخالية من أي مانع ثخثر، وذلک من 203 رأس من الخيول (مهر – حصان – فرس حامل - غير حامل) وقد کانت الخيول التي أخذت منها العينات في هذا البحث غير محصنة ضد مرض الإجهاض الوبائي عند الخيل (القوباء الخيلية النمطين EHV1/EHV4) وتتراوح أعمارها بين 1 شهر حتى 23 سنة, معظم الخيول لم تبد أي أعراض مميزة للمرض عند جمع عينات الدم وأکدت القصة المرضية (تاريخ الحالة) لمعظم هذه الخيول وجود أعراض تنفسية شائعة عند کل خيول الدراسة وأعراض فردية إجهاضية سابقة عند عدد من الأفراس المدروسة وسجلت حالة عصبية وحيدة فقط. بعد جمع العينات، نقلت إلى المخابر المعنية حيث ثفلت وجني مصل الدم وأخضع لاختبار الأليزا الغير مباشرة.

صورة لقاعدة البيانات التى جمعت أثناء جمع العينات من المزارع المختلفة تبين نوع جنس ورقم العينة والملاحظات قبل عملية أخذ عينة الدم.

اختبار المقايسة المناعية المرتبط بالإنزيم ELISA للکشف عن الإجهاض الوبائي الخيلي:

استخدم کيت  ·SVANOVIR®وهو عبارة عن اختبار مقايسة مناعية مرتبطة بالإنزيم (ELISA)، من أجل الکشف عن الأضداد النوعية لحمة القوباء الخيلية النمطينEHV4/EHV1  وذلک لتحديد وجود الإصابة أو عدمها وکذلک التفريق بين الإصابة بالنمط EHV1 والنمط EHV4 . يتم الکشف عن هذه الأضداد النوعية في المصل والبلازما عند الخيول.

مبدأ الاختبار:

يتکون الکيت من أطباق خاصة باختبار الإليزا يحتوي کل منها على 96 حفرة، مطلية من الداخل بالمستضدات الخاملة لحمة الإجهاض الوبائي - النمطين  EHV1 و EHV4 حيث تتوزع الحفر في کل طبق على الشکل التالي:

-         حفر الخطوط  (1-4-7-10) تحتوي مستضدات خاصة بالنمط EHV1

-         حفر الخطوط  (2-5-8-11) تحتوي مستضدات خاصة بالنمط EHV4

-         حفر الخطوط  (3-6-9-12) تکون حفر شاهدة.

يتم توزيع کل عينة من عينات الدم المأخوذة من الخيول على الخطوط الثلاثة السابقة الذکر الخاصة بالنمط 1 و 4 والشاهد. بعد ذلک يتم الکشف عن هذه الأضداد النوعية المرتبطة بالحفر بواسطة أضداد ثانوية HRP conjugated rabbit–Anti-IgG-horse)) موسومة بالبيروکسيداز وجاهزة للاستعمال والتي تقوم بأکسدة الدارئة TMB (Substrate solution-TetraMethyl-Benzidine - TMB)، مما يؤدي إلى تشکل لون أزرق ثم أصفر عند إضافة محلول توقيف التفاعل (Stop Solution) الذي يحتوي على حمض السلفوريک. إن شدة اللون تتناسب طرداً مع کمية الأضداد النوعية للعينة الموجودة في الحفر، حيث يتم التشخيص عبر مقارنة الکثافة الضوئية الناتجة DO التي يتم الحصول عليها للعينات مع الشواهد.

طريقة العمل

توضع جميع مکونات التفاعل مع العينات في درجة حرارة الغرفة قبل البدء بالإختبار، مع رج العبوات جيداً قبل الاستخدام، ويتم الاختبار وفق الخطوات التالية:  

1- يتم تمديد عينات المصل باستخدام المحل الخاص بالعينات بنسبة 1/100.

2- نقوم بعد ذلک بتوزيع 100 ميکروليتر من کل عينة على 3 حفر من حفر الطبق: حفرة للکشف عن الأضداد النوعية للنمط 1 وحفرة للکشف عن أضداد النمط 4  وحفرة شاهد مستضدي (Control antigen)

3- نقوم بإضافة 100 ميکروليتر من محلول الشاهد الإيجابي والسلبي في الحفر الخاصة بهما في کل طبق، کما نقوم بإضافة الشاهد الإيجابي للنمط 4 في الحفر الخاصة على الطبق أيضاً. وهنا لابد من الإشارة أنه يمکن اختيار حفر الشاهد الإيجابي والسلبي ولکن من الأفضل التقيد بالتوصيات الخاصة بالشرکة المصنعة.

4- يغطى الطبق بشريط لاصق ويحضن مع الرج المستمر بدرجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين وذلک باستخدام رجاج بطيء السرعة.

5- تغسـل کل حفـرة 4 مرات بواسطـة 300 ميکروليتر من محلول الغسيل PBS Tween buffer الممدد بالماء المقطر بنسبة 1/20. ثم نقوم بتفريغه في حوض المغسلة وإجراء عدة ضربات للطبق على ورق نشاف مع مراعاة عدم تشکيل فقاعات داخل الحفر وإخراج محلول الغسيل بشکل کامل من الحفر.

6- يضــاف 100 ميکروليتـر من محلـول الأضـداد النوعيـة الثانويـة  HRP conjugated rabbit–Anti-IgG-horse)) الموسومة بالبيروکسيداز.

7- يحضن الطبق بدرجة حرارة الغرفة مع الرج المستمر لمدة ساعة واحدة.

8- تکرر المرحلة رقم /5/ من أجل الغسيل.

9- يضاف 100 ميکروليتر من محلول الدارئة (Substrate solution-TetraMethyl-Benzidine, TMB) في کل حفرة ثم يحضن الطبق لمدة 10 دقائق بدرجة حرارة الغرفة. نبدأ بالتوقيت من لحظة ملئ أول حفرة من حفر الطبق. نلاحظ خلال التحضين ظهور اللون الأزرق الغامق في الحفر الحاوية على الأضداد النوعية لنوع المستضد الملتصق بالحفرة وکذلک ظهور اللون الأزرق في حفر الشاهد الإيجابي للنمطين (A1,A2) وحفرة الشاهد الإيجابي للنمط 4 (C2).

10- يتم إيقاف التفاعل بإضافة 50 ميکروليتر من المحلول الموقف للتفاعل بنفس الترتيب عند إضافة الدارئة للحفر کلها. نلاحظ عند ذلک تحول اللون الأزرق إلى اللون الأصفر مباشرةً.

11- تقرأ النتيجة باستخدام مقياس الطيف الضوئي على موجة طولها 450 نانومتر.

قراءة النتائج:

بعد قراءة الجهاز للطبق نقوم بتصحيح أرقام القراءة للطبق باستخدام معادلة التصحيح الخاصة بالشرکة الصانعة وفق التالي:

الکثافة البصرية المصححة = الکثافة البصرية _{للحفرة الحاوية على المستضد}                     – الکثافة البصرية _{للحفرة الحاوية على الشاهد المستضدي}

OD Corr = OD Antigen - OD Control antigen

الکثافة البصرية المصححة للحفرة الحاوية على محلول الشاهد الإيجابي يجب أن تکون أعلى من 0.6 والحفر الحاوية على الشاهد السلبي يجب أن تکون کثافتها البصرية المصححة أقل من 0.1.

تفسير النتيجة:

الکثافة البصرية > 0.2 : العينة المصلية إيجابية للحفرة.

الکثافة البصرية < 0.1 : العينة المصلية سلبية للحفرة.

الکثافة البصرية 0.1 – 0.2 : العينة المصلية مشتبهة.

أما فيما يتعلق بالحساسية والنوعية لهذا الاختبار فقد درست من قبل کارفالو ورفاقه فکانت الحساسية 100% أما النوعية فکانت 94.7% (Carvalhoet al., 2000).

Results

النتائـج

أظهرت نتائج اختبار الإليزا غير المباشرة (المقايسة المناعية الأنزيمية) المستخدمة بهذه الدراسة إکتشاف الأضداد النوعية لحمة الإجهاض الوبائي النمط EHV1 في سبع حالات من مجموع الخيول التي أخذت منها العينات والبالغ عددها 203 خيلاً (7 / 203) بنسبة إصابة تشکل 3.5%. وقد لوحظ من النتائج عدم تسجيل أي حالة إيجابية للنمط EHV1 في کل من المنطقة الساحلية والشرقية بينما کانت نسب الإصابة في کل من المنطقة الشمالية (2.2%) والوسطى (8%) والجنوبية (4%). أما بالنسبة للنمط EHV4 فقد سجلت النتائج إصابة 195 خيلاً من أصل 203 وبنسبة إصابة وصلت إلى 96%. کما لوحظ أن عدد الخيول التي أکتشفت فيها الأضداد النوعية للنمطين هي (7) حالات فقط من مجموع الحالات المدروسة في هذا البحث (الجدول رقم 1).

الجدول رقم 1: يبين توزع العينات الإيجابية مصلياً والنسب المئوية للإصابة لکلا نمطي المرض (EHV4/EHV1) في المناطق المختلفة من سورية. 

التحليل الإحصائي للنتائج :

استخدمنـا في التحليـل الإحصـائي لهـذا المسـحتـوزيع المعاينـة للنسبـةThe Sampling Distribution of the Proportion :

إن مفهوم توزيع المعاينة للنسبة هو نفس ذلک التوزيع المتعلق بمعدلات العينات المدروسة فهو توزيع افتراضي لخصائص مشاهدات تکون فيها الفوائد مقدرة عندما نريد أن نحصل على استنتاج إحصائي للنسب المئوية لقطيع من القطعان أو مزرعة من المزارع أو مجموعات من حيوانات نريد دراستها.

وبالتالي فإن النتائج تکون کالتالي :

(SE_p1=0.14) (0.013-0.07, CI 95%)

ثقتنا (95%) للنسبة الحقيقية للخيول التي تحمل أضداد إيجابية لمرض الإجهاض الوبائي عند الخيل (القوباء الخيلية النمط EHV1 ) مابين (0.013 – 0.07)

(SE_P4=0.014) (0.93-0.98 , CI 95%)

ثقتنا (95%) للنسبة الحقيقية للخيول التي تحمل أضداد إيجابية لمرض الإجهاض الوبائي عند الخيل (القوباء الخيلية النمط EHV4 )  مابين (0.93 – 0.98)

Discussion

المناقشـة

إن الغاية من هذه الدراسة هي الکشف عن الأضداد الخاصة بالحمة المسببة لمرض الإجهاض الوبائي عند الخيول (النمطين EHV1 و EHV4) وحساب نسبة الإصابة الحقلية والکشف عن خطورة انتقال وتکاثر الحمة المسبب للمرض بين المناطق المدروسة.

فقد أکد الباحثون على أهميـة هذا المرض من حيث کمون الإصابة وعودتها في أي لحظة  وسرعة انتشار هذا المرض وصعوبة الوقاية منه وعلاجه فهـو مرض حموي يصيب الخيـل يتصف بالحمى والتهاب رشحي للأغشيـة المخاطيـة للرأس والمجاري التنفسيـة العليا وإجهاض الإناث الحوامل وظهـور الأعراض العصبيـة وبالتالي الخسائر الفادحة التي تصيب هذا القطاع عند انتشار هذا المرض         (O’Callaghan et al., 1983 ; Allen and Bryans, 1986 ;              Bryans and Allen, 1988 ; Matsumura et al., 1992 ;                  Crabb and Studdert, 1995 ; Allen et al., 1999)

فقد أثبت وجود المرض في مناطق عديدة من العالم والتي تهتم بتربية الخيول وهي تعاني من المرض ولم تجد له حلولاً مجديةً حتى الآن رغم التطور الذي رافق تربيــة هذه الحيوانات في الآونـة الأخيـرة والمبالغ الطائلــة التي تصرف على هذه التربية فقــد أثبت وجود المرض في بريطانيا (Powell et al., 1976)    وأمريـکا (Doll and Bryans, 1963; Mumford et al.,1998) وکنــدا (Carman et al., 1997) وأستراليا(Bagust and Pascoe, 1968 ;     Duxbury and Oxer, 1968 ; Studdert et al., 1974 ;                     Crabb and Studdert, 1995; Gilkerson et al., 1997 ;              Gilkerson et al., 1999)

ونيوزيلندا(Jolly et al., 1986)  واليابان (Kawakami et al., 1962) وترکيا al., 2009) et Ataseven(Gür,s and Yapici., 2008; والإمارات(OIE,2010)  وجنوب إفريقيا (Mason et al., 1989).  

إن المسوحات السابقة للکشف عن المرض والتي استعانت بالاختبارات المصلية مثل إختبار تثبيت المتممة واختبار التعادل المصلي لم تفلح في تحديد نمط الإصابة الحموية ولم تفرق بين الأضداد النوعية لکل نمط بسبب التفاعل التصالبي المستضدي للحمتين. وفي أواسط التسعينات تم تطوير نوع خاص من الإليزا لتشخيص الإصابة بين النمطين EHV1 و EHV4 يعتمد على تقنية جديدة تعتمد على اختلاف الجزء الطرفي (C) البروتيني من البروتين السکري (G) (C-terminal portion of glycoprotein G) لکلا النمطين الحمويين. وتعد الإليزا المطورة طريقة مفضلة يعتمد عليها بسبب الفائـدة التطبيقيـة لهذا الإختبار وحساسيته بالمقارنـة مع الاختبارات المصلية الأخرى (Crabb and Studdert 1993 ; Crabb et al.,1997 ; Yasunaga et al., 2000 ; Hartley et al., 2005).

کما أکد  et al., 2000) (Van Maanen أن الإليزا أکثر حساسية من اختبار التعادل المصلي حيث وجد تقارب شديد بين الاختبارين، غير أن الإليزا أکثر حساسية فإن المعايير القليلة کانت تظهر نتيجة إيجابية في اختبار التحدي لجرعة ضعيفة من المرض في الحيوانات الخالية من المرض کما أن الإليزا تحسست لارتفاع الأضداد النسبي عند التطعيم الثانوي في اختبار التحدي نفسه کما أن الإليزا أسهل وأسرع من اختبار التعادل وهو يعتبر أداة ثمينة في تشخيص المرض بالطرق المصلية.

وقد قام Yasunaga et al., 1998) ) بإجراء مسح للتقصي عن المرض في اليابان بإستخدام طريقة الإليزا غير المباشرة المطورة التي تعتمد على الغليکوبروتين (glycoprotein Gs (gGs)) للنمط الحموي 1 والنمط 4 وباستخدام هذه الطريقة تم التفريق بين الإصابتين وهذه التقنية هي نفس التقنية التي استخدمت في هذا البحث وهي نفسها التي تم اعتمادها في الکشف عن المرض في ترکيا  (Gür, 2008; Ataseven et al., 2009).

في دراستنا هذه تم أخذ العينات من مزارع خيول متخصصة بتربية أفراس التکاثر ونوادي الخيل المتخصصة بتربية خيول القفز والرياضة المختلفة وخيول فردية في مزارع خاصة منتشرة على کافة منطقة الدراسة حيث بلغ عدد العينات 203 عينة. أظهرت الإختبارات المصلية نسب إصابة متقاربة بالنمط4 بين المناطق المدروسة، وقد سجلت أعلى نسبة للحالات الإيجابية مصليا للنمط 1 في المنطقة الوسطى حيث بلغت 8% وسجلت أقل نسبة  من الحالات الإيجابية مصليا في المنطقة الشمالية حيث بلغت 2,2% وبالمقابل سجلت أعلى نسبة حالات إيجابية للنمط 4 في المنطقة الساحلية حيث بلغت 100%.

لقد کانت نتائج الإختبار مماثلة لتلک التي سجلت في الأبحاث التي جرت مسبقاً في دول مجاورة کتلک التي سجلت في مناطق قريبة من منطقتنا کترکيا فقد سيطرت الإصابة بالنمط 4 على معظم النتائج الإيجابية مصلياً حيث بلغت نسبة الإصابة الکلية في هذا البلد بهذا النمـط 57% من مجموع خيـول التجربة البالغ 188 عينة أما نسبة الإصابة بالنمط 1 فقد بلغت 3,7% من مجموع 188 عينة (Gür, 2008).

وفي دراسة أخرى قام بها, 2009) Ataseven) وجد أن نسبة الإصابة بالنمط 4 وصلت إلى 81% عام 2009 في ترکيا. أما في اليابان فقد بينت الدراسات أن النتائج الإيجابية مصلياً کانت کالتالي: 30/80 عينة إيجابية مصلياً بالنمط 1 و 9/80 عينة إيجابيـة مصليـاً للنمـط 4 وذلک عام 1995- 1996 وذلک حـسـب Yasunaga, 1988) )

وحسب تقارير مکتب الأوبئة الدولي للعينات الواردة إلى المخابر کانت النتائج في الإمارات العربية المتحدة تم الاشتباه بثلاث حالات إصابة بمرض الإجهاض الوبائي تبين وجود حالة إيجابية واحدة بعد عمليات عزل الفيرس (OIE, 2010) أما في جنوب إفريقيا فقد وصلت نسبة الإصابة بالمرض 6.77% من مجموع عينات مشتبه قدرها 325 عينة مشتبه بالمرض (OIE, 2009) کما بنت تقارير مکتب الأوبئة الدولي نشر في موقع إلسيفر وجود حالات إيجابية في فلسطين المحتلة فقد تم إثبات أربع حالات إيجابية بالمرض من بين عشرين حالة مشتبه جمعت من عدة مناطق (intl.elsevierhealth.com/journals/trst) کما أکد کراب ورفاقه (Crabb et al., 1997) أنه في إحدى الدراسات للتقصي باستخدام الإليزا المطورة عن القوباء الخيلية النمطين المصليين 1/4 کانت کل العينات إيجابية للنمط المصلي 4 وهذا ما يتوافق مع النتائج التي حصلنا عليها في هذه الدراسة.

وحسـب دراسـات أخرى قام بها  (Crabb and Studdert, 1993 ; Gilkerson et al., 1994 ; Van Maanen et al., 2000)، فإن النمط 1 يسبب إصابات مرضية أکثر خطورة من الإصابات التي يسببها النمط 4 .

يستنتج من هذه الدراسة إن مرض الإجهاض الوبائي هو تطور للإصابة بحمة القوباء الخيلية النمط 1 الذي يترافق بإصابة تنفسية بداية ثم يتطور للإجهاض وقد يتطور للإصابة العصبية. وأن انتشار مرض الإجهاض الوبائي في سورية لا يزال محدوداً ولم تتعد نسبة الإصابة الکلية في جميع مناطق الدراسة الـ 3.5%. إن انتشار الشکل التنفسي غير الخطير کان مرتفعاً فقد وصلت نسبة الإصابة في بعض المناطق حتى 100%. وإن انتشار الشکل التنفسي للمرض کان نتيجة الصفات الخاصة التي يتمتع بها فيروس القوباء من حيث الإصابة الکامنة وسرعة الإنتشار. وقد توفرت بعض العوامل التي ساعدت على انتشار الشکل التنفسي ألا وهي انعدام إجراءات الأمن الحيوي في أغلب الإسطبلات التي تمت زيارتها والإفراط من قبل مربي الخيول في الاعتماد على الکلافين في إعطاء الأدوية بصورة عشوائية دون الاستعانة بالطبيب البيطري. وقد لوحظ عدم جدوى استخدام اللقاح ضد مرض الإجهاض الوبائي حتى تاريخ کتابة هذا البحث.

References

Allwn, G.P.; Kydd, J.H.; Slater, J.D. and Smith, K.C. (1999): Recent advances in understanding the pathogenesis, epidemiology, and immunological control of equid herpesvirus-1 (EHV-1) abortion. Equine Infect. Dis., 8: 129–146.

Allen, G.P.; Kydd, J.H. and Slater, J.D. (2004): Equid herpesvirus 1 and equid herpesvirus 4 infections. In: Coetzer JAW, Tustin RC, eds. Infectious Diseases of Livestock, 1^st ed. Newmarket: OxfordUniversity Press., 829–859.

Allen, G.P. and Bryans, J.T. (1986): Molecular epizootiology, pathogenesis, and prophylaxis of equine herpesvirus-1 infection. in Veterinary Microbiology and Immunology, 2: 78–144.

Ataseven, V.S.; Dagalp, S.B.; Güzelm, Basaran, Z.; Tan, M.T.and Geraghty, B. (2009): Prevalence of equine herpesvirus-1 and equine herpesvirus-4 infections in equidae species in Turkey as determined by ELISA and multiplex nested PCR. Res. Vet. Sci., 86(2): 339-44.

Bagust, T.J. and Pascoe, R.R. (1968): Isolation of equine rhinopneumonitis virus from acute respiratory disease in a horse in Queensland.Aust. Vet. J., 44: 296.

Ballagi, A.; Klingeborn, B.; Flensburg, J. and Belak, S. (1990): Equine herpesvirus type 1: detection of viral DNA sequences in aborted fetuses with the polymerase chain reaction. Vet. Microbiol., 22: 373–381.

Betteridge, K.J. (1989): The structure and function of equine capsule in relation to embryo manipulation and transfer. Equine Vet. J., 8: 92–100.

Borchers, K. and Slater, J. (1993): A nested PCR for the detection and differentiation of EHV-1 and EHV-4. J. Virol. Methods, 45: 331–336.

Bryans, J.T. and Allen, G.P. (1988): Herpesviral diseases of the horse. In: Herpesvirus Diseases of Animals,Wittman G., ed. Kluwer, Boston, USA, 176–229.

Bryans, J.T. and Allen, G.P. (1989): Herpesviral diseases of the horse. In: Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, Ed: G. Wittmann, Kluwer, Boston, pp. 176-229.

Bryans, J.T. (1981): Application of management procedures and prophylactic immunization to the control of equine rhinopneumonitis. In: Proc. Am. Ass. Equine Practnrs, Anaheim, pp. 259-272.

Carman, S.; Rosendal, S.; Huber, L.; Gyles, C.; Mckee, S.; Willoughby, R.A.; Dubovi, E.; Thorsen, J. and Lein, D. (1997): Infectious agents in acute respiratory disease in horses in Ontario. J. Vet. Diagn. Invest., 9: 17–23.

Carter, G.R. and Wise, D.J. (2006): A Concise Review of Veterinary Virology, International Veterinary Information Service, IthacaNY (www.ivis.org), Last updated: 9-May-2006; A3411.0506.

Carvalho, R.; Passos, LMF.; Gouvea, A.M.G.; Resende, M.; Martins, A.S. and Franco, G.C. (2000): Use of an ELISA system for detection of equine herpesvirus 1 (EHV-1) antibodies in non-symptomatic pregnant mares and neonatal foals.Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., 52, 3.

Carvalho, R.; Passos, LMF.; Oliveira, AM.; Henry, M. and Martins, A.S. (2000): Detection of equine herpesvirus 1 DNA in a single embryo and in horse semen by polymerase chain reaction. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., 4–52.

Crabb, B.S. and Studdert, M.J. (1995): Equine herpesviruses 4 (equine rhinopneumonitis virus) and 1 (equine abortion virus). Adv. Virus Res., 45: 153–190.

Crabb, B.S. and Studdert, M.J. (1993): Epitopes of glycoprotein G of equine herpesviruses 4 and 1 located near the c-termini elicit type-specific antibody responses in the natural host. J. Virol., 67: 6332-6338.

Crabb, B.S. and Studdert, M.J. (1994): Equine herpesviruses 4 (equine rhinopneumonitis virus) and 1 (equine abortion virus). Adv. Virus Res., 45: 153-190.

Crabb, B.S.; Macpherson, C.M.; Reubel, G.H.; Browning, G.F.; Studdert, M.J. and Drummer, H.E. (1997): Archives of Virology,  140(2): 245-258.

Doll, E.R. and Bryans, J.T. (1963): A planned infection program for immuniz­ing mares against viral rhinopneumonitis. Cornell. Vet., 53: 249-262.

Dutta, S.K.; Talbot, N.C. and Myrup, A.C. (1983): Detection of equine herpesvirus-1 antigen and the specific antibody by enzyme-linked immunosorbent assay. Am. J. Vet. Res., 44: 1930 -1934.

Duxbury, AE. and Oxer, D.T. (1968): Isolation of equine rhinopneumonitis virus from an epidemic of acute respiratory disease in horses. Aust. Vet. J., 44: 58–63.

Edington, N.; Smith, B. and Griffiths, L. (1991): The role of endothelial cell infection in the endometrium, placenta and fetus of equid herpesvirus 1 (EHV-1) abortions. J. Comp. Pathol., 104: 379-387.

Edington, N.; Welch, H.M. and Griffiths, L. (1994): The prevalence of latent equid herpesviruses in the tissues of abattoir horses. Equine Vet. J., 26: 140-142.

Gilkerson, J.R.; Jorm, L.R.; Love, D.N.; Lawrence, G.L. and Whalley, J.M. (1994): Epidemiologic investigation of equid herpesvirus 4 (EHV 4) excretion assessed by nasal swabs taken from Thoroughbred foals. Vet. Microbiol., 39:      275-283.

Gilkerson, J.R.; Love, D.N. and Whalley, J.M. (1997): Serological evidence of equine herpesvirus 1 (EHV-1) infection in Thoroughbred foals 30–120 days of age. Aust. Equine Vet., 15: 128–134.

Gilkerson, J.R.; Teague, N.; Whalley, J.M. and Love, D.N (1999): Aprospective cohort study of upper respiratory tract disease in one and two-year old racehorses. Serological evaluation of the roleof equine herpesviruses 1 and 4 (EHV-1 and EHV-4) in respiratory disease. Aust. Equine Vet. J. 17:    76–81.

GÜr, S. and Yapici, O. (2008): Equine herpesvirus type 1 and 4 in individually reared horses in central and western Turkey. Acta Vet. Brno., 77: 609-613.

Hartley, C.A.; Wilks, C.R.; Studdert, M.J. and Gilkersony, J.R. (2005). Comparison of antibody detection assays for the diagnosis of equine herpesvirus 1 and 4 infections in horses. Am. J. Vet. Res., 66: 921-928.

Jolly, P.D.; FU, Z.F. and Rorbinson, A.J. (1986): Viruses associated with respiratory disease of horses in New Zealand: an update. N. Z.Vet. J., 34: 46–50.

Kawakami, Y.; Kaji, T.; Ishizaki, R.; Shimizu, T. and Matumoto, M. (1962): Etiologic study on an outbreak of acute respiratory disease among colts due to equine rhinopneumonitis virus. Jpn. J. Exp.Med., 32: 211–229

Mason, D.K.; Watkins, K.L. and Luk, C.M. (1989): Haematological changes in two Thoroughbred horses in training with confirmedequine herpesvirus 1 infections. Vet. Rec., 124: 503–504.

Matsumura, T.; Sugiura, T.; Imagawa, H.; Fujanaga, Y. and Kamada, M. (1992): Epizootiological aspects of type 1 and type 4 equine herpesvirus infections among horse populations. J. Vet. Med. Sci., 54(2): 207-211.

Matumoto, M.; Ishizaki, R. and Shimizu, T. (1965): Serological survey of equine rhinopneumonitis virus infection among horses in various countries. Arch. Ges. Virusforsch., 50: 609–623.

Mumford, J.A.; Traub Dargatz, J.L.; Salman, M.D.; Collins, J.K.; Getzy, D.M. and Carman, J. (1998): Monitoring and detection of acute viral respiratory tract disease in horses. J. Am. Vet. Med. Assoc., 213: 385–390.

O’callaghan, D.J.; Gentry, G.A. and Randall, C.C. (1983): The equine herpesviruses. In: Roizman B, editor. The Herpesviruses. New York: Plenum Press., p. 215–318.

OIE Terrestrial Manual, (2008): Chapter 2.5.9. - Equine rhinopneumonitis 849, 903.

OIE, WWW.oie.int, Information received on (2009): from Mr Bothle Michael Modisane, Chief Director Food and Veterinary Services, Department of Agriculture, Food Safety and Biosecurity: Department of Agriculture, PRETORIA, South Africa.

OIE, WWW.oie.int, Information received on (2010): from Eng Sumaia Al Rais, Head of Animal and Plant Health, Animal and Plant Health Department, Ministry of Environment and Water, Dubai, United Arab Emirates.

Patel, J.R. and Heldens, J. (2005): Equine herpesviruses 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4) – epidemiology, disease and immunoprophylaxis: a brief review. The Veterinary Journal, 170: 14–23.

Powell, D.G.; Burrows, R.; Spooner, P.R.; Goodridge, D.; Thomson, G.R. and Mumford, J. (1976): A study of infectious respiratory disease among horses in Great Britain, 1971 to 1976. In: Bryans, J., Gerber, H. (Eds.), Proceedings of the Fourth International Conference on Equine Infectious Diseases, Veterinary Publications, New Jersey, pp.        451–459.

Reed, S.M. and Toribio, R.T. (2004): Equine herpesvirus 1 and 4. Veterinary Clinics of North America Equine Practice, 20: 631–642.

Sabine, M.; Robertson, G.R. and Whalley, J.M. (1981): Differentiation of sub-types of equine herpesvirus 1 by restriction endonuclease analysis. Aust. Vet. J., 57: 148-149.

Slater, J. (2007): Equine herpesviruses. In: Sellon, D., Long, M. (Eds.), Equine Infectious Diseases. Saunders Elsevier, St. Louis, USA, pp. 134–153.

Studdert, M.J. (1974): Comparative aspects of equine herpesviruses. Cornell. Vet., 64: 94-122.

Telford, E.A.R.; Watson, M.S.; Mcbride, K. and Davison, A.J. (1992): The DNA sequence of equine herpesvirus-1. Virology, 189: 304–316.

Telford, E.A.R.; Watson, M.S.; Perry, J.; Cullinane, A.A. and Davison, A.J. (1998): The DNA sequence of equine herpesvirus 4. J. Gen. Virol., 79: 1197–1203.

Thomson, G.R.; Mumford, J.A.; Campbell, J.; Griffiths, L. and Clapham, P. (1976): Serological detection of equid herpesvirus 1 infections of the respiratory tract. Equine Vet. J., 8: 58–65.

Van Maanen, C. (2002): Equine herpesvirus 1 and 4 infections: an update.Veterinary Quarterly, 24: 58–78.

Van Maanen, C.; Vreeswijk, J.; Moonen, P.; Brinkhof, J.; De Boer-Luijtze, E. and Terpstra, C. (2000): Differentiation and genomic and antigenic variation among fetal, respiratory and neurological isolates from EHV 1 and EHV 4 infections in the Netherlands. Vet. Q., 22: 88-93.

Welch, H.M.; Bridges, C.G.; Lyon, A.M.; Griffiths, L. and Edington, N. (1992): Latent equid herpesviruses 1and 4: detection and distinction using the polymerase chain reaction and co-cultivation from lymphoid tissues. J. Gen. Virol., 73: 261-268.

Yasunaga, S.; Maeda, K.; Matsumara, T.; Kondo, T. and Kai, K. (2000): Application of a type spesific enzymelinked immunosorbent assay for equine herpesvirus types 1 and 4 (EHV-1 and -4) to horse populations inoculated with inactivated EHV-1 vaccine. J. Vet. Med. Sci., 62: 687-691.

Yasunaga, S.; Maeda, K.; Matsumara, T.; Kai, K.; Iwata, H. andInoue, T. (1998): Department of Veterinary Microbiology, Faculty of Agriculture, Yamaguchi University, Japan. Diagnosis and sero-epizootiology of equine herpesvirus type 1 and type 4 infections in Japan using a type-specific ELISA. J. Vet. Med. Sci., 60(10): 1133-1137.