COMPARATIVE STUDY OF NEOSPORA CANINUM STRAINS (NC-5, Nc1, BPA4) INFECTION IN NATURALLY INFECTED CATTLE IN SYRIA

COMPARATIVE STUDY OF NEOSPORA CANINUM STRAINS (NC-5, Nc1, BPA4) INFECTION IN NATURALLY INFECTED CATTLE IN SYRIA

W.A. AL-OBAIDII; M.M. KATRANJI and A. AL-KHALED

Dept of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Al-Baath University, Syria Arab Republic.

___________________________________________________________________________

                                         ABSTRACT

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

Key Words: Neospora caninum, Real Time PCR, Strains, Vero cell.

___________________________________________________________________________

دراسة مقارنة الإصابة بذراري البوغة الجديدة الکلبية (BPA4 , Nc1 , NC-5)

في الأبقار المصابة طبيعيا في سوريا

وسن امجد العبيدي , محمد محسن قطرنجي , عبد الکريم الخالد

تم جمع أعضاء (دماغ، قلب، عضلات هيکلية) من 25 جنينا مجهضا و 14 عجلا إضافة إلى جمع عينات دم من العجول، و 39 عينة دم ومشيمة من أبقار مجهضة ، وذلک بهدف عزل طفيلي البوغة الجديدة الکلبية على خلايا الزرع الخلوي (خلايا کلية أجنة القرود الإفريقية الخضراء)  والکشف عن ذراريه بتقنية تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي ، وباستخدام 3 أزواج من المشرعات للذراري (NC-5,Nc1,BPA4) ، وتبين من خلال تنمية الأعضاء على خلايا الزرع الخلوي ظهور تأثيرات مرضية خلوية ، تباينت بالشدة بين الأعضاء والتمريرات ، وإن أول ظهور للتأثيرات کان في التمريرة الثالثة لعينات القلب للأجنة ، وفي التمريرة الرابعة لعينات القلب والدماغ للعجول و لمشيمة الأبقار. وعند إجراء اختبار تفاعل سلسلة البوليمريز على قوالب جزيئه الدنا التي تم استخلاصها من المزارع الخلوية التي أظهرت نموا للطفيلي تبين وجود منحنيات تألق ايجابية ، سجلت أعلى نسبة للإصابة في المزارع الخلوية لادمغة والعضلات الهيکلية للأجنة والقلب والعضلات الهيکلية للعجول ، ودم الأبقار. وظهرت أعلى نسبة للإصابة  في الأجنة المجهضة في الثلث الثاني من الحمل ، العجول التي تعاني من عدم القدرة على النهوض وفي الابقارالتي أجهضت في الثلث الثاني ، وتبين من خلال فحص الدنا للطفيلي للکشف عن ذراري البوغة الجديدة الکلبية، إن أعلى نسبة إصابة للذرية NC-5 في عينات الدم للأبقار ، ودماغ العجول ، وفي ادمغة والعضلات الهيکلية للأجنة ،أما الذرية Nc1 فکانت نسب الإصابة فيها منخفضة في دم الأبقار والعجول وأدمغة العجول وللدماغ والعضلات الهيکلية للأجنة ، وأظهرت الذرية BPA4  أعلى نسبة إصابة في العضلات الهيکلية للعجول والأجنة  ودم الأبقار.

INTRODUCTION

المقدمــة

تعد البوغة الجديدة الکلبية من الأکريات الطفيلية Coccidian parasite ، عرف الطفيلي لأول مرة في عام 1984 م في النرويج في الکلاب من نوع Boxer dog litter  والتي کانت بأعمار 2-6 أشهر، تعاني من علامات التهاب الدماغEncephalomyelitis  والتهاب العضلات Myositis والعرج Lameness حيث سمي في ذلک الحين باسم Toxoplasma like protozoan(Bjerkas et al.,1984) ،ومن الجدير بالذکر بأنه وجد منذ عام 1988 م أن للطفيلي علاقة وطيدة بالمشاکل التناسلية في الأبقار فضلا عن تسببه في ظهور أعراضا" عصبية في العجول المولودة حديثا (Jessica et al., 2011) ، وتتعلق هذه الأعراض بغزو الحيوانات التسرعية للطفيلي Tachyzoites لأنسجة الأم والجنين ، حيث وجدت في أنسجة مختلفة في جسم الثوي خلال الطور الحاد للمرض بينما وجدت الأکياس النسجية Tissue cyst في الطورين الحاد والمزمن وخصوصا في الدماغ (Timothy et al., 1999) ، ويعد تشخيص طفيلي البوغة الجديدة الکلبية صعبا " نظرا" لعدم وجود أعراضا "مرضية متخصصة في الأبقار وکذلک عدم وجود اختبارات طفيلية تشخيصية لها القدرة لتمييزها، بالإضافة إلى ذلک فان السيطرة على البوغة الجديدة الکلبية يفتقر لوجود لقاح ناجح أو علاج له القدرة على تقليل تکاثر الطفيلي في الأنسجة (Habibi et al., 2005).

ويعتمد تشخيص البوغة الجديدة الکلبية على عدة جوانب منها، التقصي عن الأضداد المتخصصة للطفيلي في مصول الحيوانات المصابة من خلال عدة اختبارات مصلية منها تقنية المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم ELISA ، اختبار الومضان المناعي غير المباشر IFAT ، اختبار التراص المباشر DAT (Dubey et al., 2007)، أو من خلال الکشف عن الطفيلي زرعيا " بإنمائه الطفيلي على خلايا الزرع الخلوي وذلک نظرا" لقدرة الحيوانات التسرعية على النمو على عدة أنواع من خلايا الزرع الخلوي منها (خلايا کلية أجنة القرود الإفريقية الخضراء ، خلايا بطانة الشريان الرئوي والخلايا وحيدة النواة للأبقار) ، حيث تستخدم هذه الخلايا بصورة واسعة في تنمية الحيوانات التسرعية وذلک بغرض إکثار أعدادها ، ودراسة البنية المستدقة ، والصفات المستضدية ، والدراسات الجزيئية ، ودراسة قدرة الحيوانات التسرعية على الالتصاق على الخلايا وﺁلية ذلک (ميکانيکيتها) ، ودراسة حيوية الحيوانات التسرعية ومن ثم تحقيق الهدف الرئيسي ألا وهو تشخيص الطفيلي (Katarina et al., 2011) ، لذلک اتجهت الأبحاث في السنوات الماضية إلى تقنية متقدمة تهدف إلى الکشف عن الدنا للطفيلي من خلال تقنية تفاعل سلسلة البوليمريز Polymerase Chain Reaction (PCR) ، حيث تعتبر طريقة حساسة للکشف ، وذلک من خــلال تضخيــم لمــورث محـدد للطفيلي ومـن ثــم تحديده (Norbert et al., 2002) ، حيث يعد المورث Nc5 أکثرها شيوعا, إلا انه وفي الآونة الأخيرة تم استخدام المورث ITS1 أيضا، وتتمتع هذه التقنية بميزات عديدة منها الحساسية العالية ، الدقة ، الکشف عن الطفيلي حتى لو کان بأعداد قليلة ، هذا بالإضافة للکشف عن الطفيلي في المزارع الخلوية ، وأنسجة الجنين وألام، والسوائل الجنينية ، والکشف عن الدنا للحيوانات التسرعية ، والحيوانات البطيئة Bradyzoites والکيسة البيضية oocyst، وکذلک القدرة عن الکشف عن الطفيلي في أثوياء متعددة لتشمل الحيوانات المختبرية أيضا (Esther et al., 2002) ، وطورت هذه التقنية لتشمل أنواعا دقيقة جدا مثل (ذات الوقت الحقيقي Real Time ، المتداخل Nested ، نصف المتداخل Seminested ، الکمي التنافسي Quantitive –Competitive التي تعتبر ذات قدرة عالية وسريعة لتقدير کمية ونوعية الطفيلي في الأنسجة وفضلا عن ذلک يوجد النوع التقليدي للتقنية ( Classic PCR) والتي لها فوائد أخرى منها تشخيص الذراري المتعددة للطفيلي من خلال استخدام أنواع متخصصة لکل ذرية من المشرعات Primers (Salehi et al., 2009).

ولعدم وجود دراسة إلى هذا الوقت تتضمن الکشف عن الطفيلي وذراريه في سوريا فقد أنجزت هذه الدراسة لأول مرة في سوريا وذلک لتحقيق الأهداف التالية:

1- عزل طفيلي البوغة الجديدة الکلبية من أنسجة الأبقار،العجول والأجنة المجهضة على خلايا الزرع الخلوي من نوع خلايا کلية أجنة القرود الإفريقية الخضراء.

2- المقارنة بين نسب الإصابة بذراري البوغة الجديدة الکلبية من خلال تقنية تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي Real Time PCR.

MATERIALS and METHODS

المواد وطرق البحث

1-جمع العينات:

 تم جمع عينات من 25 جنينا مجهضا وبأعمار مختلفة، فضلا عن جمع عينات من 14 عجلا ولدت ضعيفة ويعاني البعض منها من أعراض عصبية وعدم القدرة على الوقوف، حيث جمعت العينات بعد نفوق العجول إضافة إلى جمع المشيمة وعينات الدم من 39 بقرة تعاني من الإجهاض وبفترات حمل مختلفة .

 وضع الدم في أنابيب اختبار حاوية على مانع تخثر (هيبارين) أضيف لها حجم مماثل من الفايکول ومن ثم وضعت في جهاز المثفلة 2000 دورة /دقيقة , 4 م ە ، 10 دقائق سحبت طبقة الخلايا اللمفاوية (Buffy Coat ) وحفظت في 4 م ە لحين إجراء إنماء الطفيلي، وتم إجراء الصفة التشريحية على الأجنة المجهضة والعجول النافقة باستخدام أدوات جراحية معقمة واخذ منها الدماغ ، أجزاء من العضلات الهيکلية والقلب بالإضافة إلى أجزاء من المشيمة من الأبقار، وقد وضعت أجزاء من هذه الأعضاء في قوارير معقمة معدة مسبقا لهذا الغرض حيث تکون حاوية على محلول دارئة الفوسفات (PBS) متعادل والحاوي على 100 وحدة دولية / 1 مليلتر من البنسلين ج ( Penicillin G) ، سلفات الستربتومايسين  بمقدار 50 مايکروغرام/ 1 مليلتر (Streptomycin Sulfate) وسلفات الجنتاميسين (Gentamicine Sulfate ) بمقدار 50 ملغم/ 1 لتر وصادات فطور متمثلـة امفوتريسين ب (Amphotericin B) بمقدار 2.5 ملغم/ 1 لتر وذلک لغـرض عــزل الطفيلــي علــى خلايــا الـــزرع الخلـــوي (Masumi et al., 2000).

2- عزل الطفيلي:

 تم أخذ 20 غراما" من  الأعضاء المضاف إليها محلول داريء الفوسفات الحاوية على الصادات الحيوية کل عضو على حده ، وقطعت في هاون خزفي معقم إلى قطع صغيرة باستخدام مقص جراحي معقم، ونقلت العينة بعد ذلک إلى حوجلة الهضم بالتربسين ( Trypsinized Flask) ، ووضع معها قطعة من مغناطيس معقم ومن ثم أضيف إليها 40 مليلتر من محلول دارئة حاوي على 0.25% تربسين و 0.025 % من ملح EDTA (Ethylene Diamin Tetraacetic Acid ) ،حيث حضنت بدرجة 37م ە  لمدة 45 دقيقة مع التحريک المستمر باستخدام جهاز المزج المغناطيسي ، ثم وضع المزيج في أنابيب معقمة ووضعت في جهاز المثفلة المبردة (4 م ە)  2000 دورة/دقيقة لمدة 10 دقائق ، وتم التخلص من الراشح ، ثم أضيف 10 مليلتر من الوسط الزرعي للنمو MEM (Minimal Essential Media ) ،إلى الراسب وتم مزجهما جيدا ومن ثم وضع المزيج في جهاز المثفلة، تم تکرار هذه العملية ثلاث مرات لغرض غسل الراسب ومن ثم علق هذا الراسب في 10 مليلتر من الوسط الزرعي للنمو MEM ليحفظ في درجة حرارة  4 م ە لحين إجراء الإنماء على خلايا الزرع الخلوي (Nathalie, 2003).

3-  تحضير الوسط الزرعي للنمو Growth Media:

تم إضافة 10.69 غرام من الوسط الزرعي مع 10 غرام من مرق التربتوز الفوسفاتي Tryptose phosphate broth ،0.584 من الکلوتامين L-glutamine ، 1.5 غرام بيکاربونات الصوديوم NaHCO3(2H2O) ، 100000  وحدة دولية بنسلين ج Penicillin G،  100ملغرام سلفات الستربتومايسين Streptomycin Sulfate، 50 ملغرام سلفات الجنتاميسين Gentamicine sulfate ، 2.5 ملغرام امفوتريسين ب Amphotericin B ، تم إذابة الخليط في ماء مقطر ثنائي التقطير وخال من الکهارل (900 مليلتر) ويتم التأکد من الباء هاء PH=7.2) ، ومن ثم رشح تحت ضغط موجب (20 مايکرون) تم إضافة 100 مليلتر من مصل الجنين البقري وحفظ في 4 م⁰ ، (Rai,2008).

4- خلايا الزرع الخلوي المستمر :

تم استخدام خلايا زرع خلوي من نوع خلايا کلية جنين القرود الخضراء الأفريقية Vero cell ، حيث تم الحصول عليها من قسم اللقاحات- مديرية الصحة الحيوانية التابعة لوزارة الزراعة في دمشق ، وتم الإنماء والإکثار للطفيلي.

5- إنماء الطفيلي:

  تم إتباع طريقة (Yamane et al., 1997) ، حيث تم مزج العالق الذي تم تحضيره مسبقا في عملية عزل الطفيلي ب 10 مليلتر من خلايا کلية أجنة القرود الخضراء الأفريقية ومن ثم حضنت لمدة 4 ساعات بدرجة حرارة 37 م ە  ووضع المزيج في أنابيب معقمة في جهاز المثفلة 2000 دورة لمدة 10 دقائق ومن ثم تم التخلص من الراشح، وغسل الراسب الحاوي على الخلايا ثلاث مرات بمحلول دارئة الفوسفات المعقمة والذي يکون بدرجة حرارة 37 م ە ، ونقلت الخلايا فيما بعد إلى الحوجلة الخاصة للزرع الخلوي (Falcon سعة 50 مليلتر) ومن ثم أضيف إليها وسط النمو (Growth media) ، تم تحضين الخلايا في 37 م ە ، 5% CO2، وتم مراقبة الخلايا يوميا بفحصها تحت المجهر ويراعى استبدال الوسط کل 5 أيام وإجراء تمريره واحدة کل 40 يوما من التحضين ولستة تمريرات.

6- استخلاص الدنا DNA Extraction:

تم إجراء استخلاص الدنا حسب تعليمات الشرکة المصنعة للعتيدة (OMEGA bio-ket)

- تحضير المحاليل:

* تحضير إنزيم البروتينازK(Proteinase K): تم إذابة الإنزيم والبالغة کميته 120 ملغم في 4.8 مليلتر من دارئة حفظ إنزيم البروتيناز Proteinase storage buffer.

* تحضير دارئة الغسلSPM Wash buffer : تم إضافة 42 مليلتر من الايتانول المطلق 100% إلى 60 مليلتر من دارئة الغسل لتکون جاهزة للاستخدام.

*تحضير دارئة MP: تم إضافة 60 مليلتر من الايتانول المطلق 100% إلى 40 مليلتر من دارئة MP  لتکون جاهزة للاستخدام.

- استخلاص الدنا للطفيلي DNA من المزارع الخلوية:

تم حصاد الخلايا من حوجلة الزرع الخلوي باستخدام مکشطة الخلايا المطاطية cell scraper،ثم تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول دارئة الفوسفات البارد(4م ە) ، وتم تعليقها في دارئة الفوسفات البارد (4 م ە) 180 مايکروليتر ,ومن ثم إضافة 20 مايکروليتر من إنزيم بروتينازK (Proteinase K) (25 mg /ml) ،ومزج جيدا وحضن في الحمام المائي الهزاز 55 م ە لمدة 10 دقائق ، وتم بعد ذلک نقل العينة في أنابيب ابندورف Eppendorf حجم 1.5 مليلتر معقمة ، وبالتالي إضافة 200 مايکروليتر من دارئة MSL ومزج جيدا وحضن 10 دقائق عند درجة حرارة 70 م ە، وترک الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم أضيف الايتانول المطلق 100% بمقدار 260مايکروليتر مع 10 مايکروليتر من الجزيئات المغناطيسية Mag –Bind Particles و 10 مايکروليتر من دارئة LPA ،ومزج جيدا وحضن لمدة 5 دقائق في درجة الغرفة ، ووضع الأنبوب فوق جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 7 دقائق ، ثم أزيل السائل الراشح باستخدام ماصة دقيقة ، وتم إضافة 400 مايکروليتر من دارئة MP ومزج جيدا" ، وحضن بعد ذلک لمدة3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ووضع الأنبوب فوق جهاز الفصل المغناطيسي  لمدة 7 دقائق و تم التخلص من الراشح باستخدام ماصة دقيقة وأضيف 400 مايکروليتر من محلول دارئة الغسل SPM Wash Buffer مع المزج الجيد وحضن 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ،ووضعت بعدها الأنبوبة على جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 7 دقائق ، وتم التخلص من الراشح باستخدام ماصة دقيقة، وأعيدت عملية الغسل بدارئة الغسل SPM Wash Buffer 400 مايکروليتر،  ثم تم التأکد من خلو الأنبوبة من أي کمية من الراشح وأضيف دارئة الشطف Elution Buffer 200 مايکروليتر لشطف الدنا عن الجزيئات المغناطيسية مع مراعاة المزج الجيد ومن ثم تم التحضين 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ووضعت الأنبوبة بعدها فوق جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 7 دقائق و سحب الراشح الحاوي على جزيئات الدنا المستخلصة ونقل إلى أنبوبة ابندورف Eppendorf حجم 1.5 مليلتر معقمة أخرى، وحفظ الأنبوب في -70 م ە لحين إجراء اختبار تفاعل سلسلة البوليمريز عليه.

7- تفاعل سلسلة البوليمريز –ذو الوقت الحقيقي Real Time PCR

تم استخدام العتيدة المنتجة من قبل شرکة (Genekam Biotechnology AG Germany) (الشکل-1-) والتي تعتمد على صبغات ومضانية Fluorogenic

- (Carboxy –fluorescein (quencher) ).

(6-carboxy tetramethyl rhodamine(reporter)).

7-1- المحاليل والمواد المستخدمة في تفاعل البوليمريز 

عبارة عن مزيج تفاعل يحتوي على کل مکونات التفاعل مع المشرعات وقالب الدنا المراد اختباره، ويتکون مزيج التفاعل لکل عينة حجم 25 مايکروليتر من المواد التالية:

7-2- المشرعات أو البادئات: Primers

صنعـت هـذه المشرعات من قبل شرکة GenBank Accession، وتم انتقاء هذه المشرعات من أجل تضخيــم المورثـات لکل من الـذراري (NC-5, Nc1 and BPA-4) (Nathalie, 2003) ، وقد تضمنت 3 أزواج من المشرعات وکما يلي:

7-3- خطوات عمل تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي:

أجري اختبار تفاعل البوليمريز المتسلسل ذو الوقت الحقيقي حسب الطريقة الموصوفة من قبل (Esther et al.,2002) حيث أجري الأختبار في حجم تفاعل کلي من 25 مايکروليتر في طبق الاختبار الحاوي على 96 حفرة (Plate) حيث أضيف في کل حفرة 0.2 مايکروليتر من کل بادئ من البادئات  Primersو 5 مايکروليتر من وقالب الدنا Template DNA وباقي الحجم من محلول مزيج التفاعل الجاهز Master mix الحاوي على جميع مکونات التفاعل باستثناء البادئات وقالب الدنا، ثم وضع بعد ذلک طبق الاختبار في المبلمر الحراري (Thermocycler)(الشکل-2-). وأجريت عملية التضاعف  Amplificationبواسطة جهاز المبلمر الحراري المبرمج على خمسين دورة بعد خطوة المسخ Denaturating  95ºم لمدة 10 دقائق. وقد شملت کل دورة مسخ عند درجة حرارة 94 ºم لمدة خمسة ثواني 25 دورة، ارتباط Annealingالبادئ أو المشرع بدرجة 60 ºم لمدة15 ثانية، واستطالة  Elongationعند درجة حرارة 72 ºم لمدة 15 ثانية، ثم  25 دورة مسخ 94 ºم لمدة 5 ثـواني , ارتباط 66 ºم لمدة 5 ثواني , استطالة 72 ºم لمدة 45 ثانية  .

            الشکل (1) عتيدة تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقى               الشکل (2) جهاز البلمرة الخاص لتفاعل سلسلة البوليمريز

                                                                                                                      ذو الوقت الحقيقي

RESULTS

النتـــائج

تبين من خلال تنمية الأعضاء المختلفة المأخوذة من الأجنة المجهضة ،العجول والأبقار على خلايا الزرع الخلوي من نوع خلايا کلية أجنة القرود الأفريقية الخضراء(شکل-3-) ولستة تمريرات وجود تمريرات عمياء (Blind passage) حيث کانت متباينة حسب مصدر ونوع العضو المراد عزل الطفيلي منه ، ومن ثم ظهور تأثير مرضي على الخلايا Cyto Pathic Effect (CPE) متمثلة بظهور فجوات بين الخلايا Vacule (شکل-4-) وتمزق في الخلايا Rupture (شکل-5-) وظهور الحيوانات التسرعية (شکل-6-) حيث کانت هذه التأثيرات متباينة الشدة بين الأعضاء والتمريرات وازدادت شدة بزيادة التمريرات , جدول-1-.

جدول 1: يبين التغيرات المرضية الخلوية Cyto Pathic Effect على خلايا الزرع الخلوي لخلايا کلية أجنة القرود الأفريقية الخضراء

           الإشارات التالية (-) عدم ظهور تأثير خلوي ,(+) ظهور تأثير خلوي

                               شکل (3) خلايا کلية أجنة القرود الأفريقية                      شکل (4) ظهور التأثير المرضي الخلوي (الفجوات)

                                     الخضراء قبل حقنها بالطفيلي.                                          في خلايا الزرع الخلوي

                  شکل (5) ظهور التأثير المرضى الخلوى                                 شکل (6) ظهور الحيوانات التسرعية للطفيلى

                   (تمزق الخلايا) فى خلايا الزرع الخلوى                                            فى خلايا الزرع الخلوى

تبين من خلال تنمية أعضاء الأجنة المجهضة على خلايا الزرع الخلوي من نوع خلايا کلية أجنة القرود الأفريقية الخضراء أن أول ظهور للتأثيرات المرضية للخلايا کان في التمريرة الثالثة لعينات القلب، بينما کان أول ظهور للتأثيرات المرضية للخلايا في عينات العجول حديثة الولادة  کان ذلک للتمريرة الرابعة لعينات القلب والدماغ سويا"، في حين لم يظهر أي تأثير مرضي للخلايا لعينات دم العجول، فيما کان أول ظهور للتأثيرات المرضية الخلوية في التمريرة الرابعة لمشيمة الأبقار ، جدول -2-.

جدول 2: يبين عدد التمريرات على خلايا الزرع الخلوي من نوع خلايا کلية أجنة القرود الأفريقية الخضراء للأعضاء التي تم جمعها

وعند إجراء اختبار تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي باستخدام ثلاث مشرعات للذراري(Nc1،NC-5،BPA4)  بينت نتائج الاختبار لمسبر DNA المصمم للمورث NC5 للبوغة الجديدة الکلبية بملاحظة منحنى التألق لدورات تضخيم تفاعل البلمرة، حيث ظهرت النتيجة الايجابية بالارتفاع التدريجي المتزايد لمنحنى الـتألق ، (شکل 7).

Cycle Number

فيما بينت نتائج الکشف عن الدنا للطفيلي في المزارع الخلوية باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي  أن أعلى نسبة للإصابة في للمزارع الخلوية المأخوذة من الأجنة ، کانت لعينات للدماغ والعضلات الهيکلية (100%) ، أما بالنسبة للمزارع الخلوية التي تمت عليها تنمية عينات العجول فبلغ أعلى نسبة إصابة لعينات القلب والعضلات الهيکلية (100%)، بينما تبين أن عينات مشيمة (90%) التي تم إنمائها على المزارع الخلوية کانت نسبتها أقل مما هو عليه الحال بالنسبة لعينات الدم (100%)، جدول(3).

جدول 3: يبين نتائج تفاعل سلسلة البوليمريز ذات الوقت الحقيقي لخلايا الزرع الخلوي المصابة بالطفيلي

   الإشارة التالية (*) عدم حصول نمو على المزارع الخلوية

بينت نتائج تنمية الطفيلي في المزارع الخلوية وتشخيصه باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي في الحيوانات المختلفة بالمقارنة مع العلامات المرضية التي تعاني منها , ظهور أعلى نسبة إصابة في الأجنة المجهضة التي أﱡجهضت في (الثلث الثاني) ، حيث بلغت 80% في کلا الطريقتين  (شکل-8-)، فيما ظهرت اقل  نسبة للإصابة في العجول التي عانت من أعراض عصبية حيث بلغت 50%(شکل-9-) ،أما الأبقار فقد سجلت فيها أعلى نسبة إصابة 41.17% التي أجهضت في(الثلث الثاني من الحمل) ، (شکل-10-)

الأشکال (10,9,8) ، تبين نسبة الإصابة بالبوغة الجديدة الکلبية باستخدام المزارع الخلوية واختبار تفاعل سلسلة البوليمريز وعلاقتها بالعلامات المرضية الظاهرة

 ( شکل-8- أجنة مجهضة ، شکل-9-عجول،  شکل-10-الأبقار)

بينت نتائج تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي للکشف عن 3 ذراري للبوغة الجديدة الکلبية (NC-5،Nc1،BPA4) وجود الدنا للطفيلي في أنسجة الأبقار للذرية NC-5، حيث سجل أعلى نسبة لها في الدم مقارنة بالمشيمة ، أما الدنا للطفيلي الذي تم الکشف عنه في أنسجة العجول للذرية NC5 فتبين أن أعلى نسبة کان في عينات الدماغ فيما انعدم في عينات الدم والعضلات الهيکلية، في حين بينت نتائج فحص أنسجة الأجنة المجهضة للذرية NC5 إن أعلى نسبة کان في أنسجة الدماغ والعضلات الهيکلية.

فيما أظهرت نتائج فحص الدنا للذرية Nc1 للعينات التي تم أخذها من الأبقار أن أعلى نسبة کان في أنسجة المشيمة وقد انعدمت النتائج في الدم ،فيما بينت نتائج الفحص في أنسجة العجول انعدام وجود الذرية فيما عدا أنسجة القلب، أما أنسجة الأجنة المجهضة فتم الکشف عن الدنا للذرية أنفة الذکر فقط في أنسجة الدماغ.

أما بالنسبة للذرية BPA4 فقد تبين من خلال فحص الدنا في أنسجة الأبقار أن أعلى نسبة إصابة لهذه الذرية کانت في الدم مقارنة بالمشيمة، في حين سجلت أعلى نسبة إصابة للذرية BPA4 للعجول والأجنة في أنسجة العضلات الهيکلية، جدول-4-.

جدول 4: نتائج اختبار تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي يبين أنواع الذراري التي تم عزلها من الأعضاء المختلفة للأبقار , العجول والأجنة المجهضة  في المزارع الخلوية

           الإشارة التالية (*) عدم حصول نمو على المزارع الخلوية

DISCUSION

المناقشة

بينت نتائج هذه الدراسة الکشف عن طفيلي البوغة الجديدة الکلبية في محطات الأبقار في سوريا من خلال عزله من أنسجة الحيوانات المصابة على خلايا الزرع الخلوي من نوع خلايا کلية أجنة القرود الأفريقية الخضراء ، حيث أظهرت الأنسجة (الدماغ  ،عضلة القلب ،العضلات الهيکلية،  المشيمة والدم) ، التي تم هضمها بالتربسين والمنتقاة من الحيوانات المصابة (أجنة مجهضة ، عجول مولودة حديثا والأبقار) ، إذ لوحظ نمو على خلايا الـزرع الخلـوي وبنسب متفاوتـة ، حيث أظهـرت المزارع الخلوية بعد حقنها بمستخلص النسيج وجود تغيرات مرضيـة خلويـة وازدادت بتقــدم التمريـرة وفترة ظهــورهـا ، إن هـذه الاختلافـات تعــود لقابليــة الذراري للبوغـة الجديدة الکلبيـة للنمـو بفتـرات زمنيـة مختلفـة ، حيث بيــن ( Katarina et al., 2011) ، حصول نمو للذرية (NC-SKB1) ، بعد11 تمريرة، بينما بين (Sawada et al., 2000) ، حصول نمو للذرية (BT-3) ، بعد 6 تمريرات. ويمکن تفسير هذا التباين بقابلية کل ذرية لسرعة تکيفها ونموها على خلايا الزرع الخلوي وملائمة نوع الخلايا لها (Gozdzik and Cabaj, 2007) ،وقد  تباينت التغيرات المرضية الخلوية في سرعة ظهورها وأشکالها حيث کانت متمثلة بظهور فجوات ، تمزق الخلايا وظهور الحيوانات التسرعية حيث ازدادت بتقدم التمريرة واختلاف الأعضاء والحيوانات ، إن هذه الاختلافات تعود إلى الاختلاف في عدد الحيوانات التسرعية في العينات حيث أنه کلما ازداد عددها زادت سرعة ظهورها إضافة إلى الاختلافات في ضراوة ذراري البوغة الجديدة الکلبية (Okeoma et al., 2004) ، وقد بينت نتائج الکشف عن الدنا باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي للبوغة الجديدة الکلبية في المزارع الخلوية التي ظهر عليها النمو ، حيث کان بنسبة عالية في أنسجة الأدمغة والعضلات الهيکلية للأجنة المجهضة ،والقلب والعضلات الهيکلية للعجول حديثة الولادة ،بينما کان في الأبقار بنسبة متقاربة في الدم والمشيمة ، إن الاختلاف في نسب ظهور ونمو البوغة الجديدة الکلبية في المزارع الخلوية للأعضاء المختلفة قد يعود لعدة أسباب منها : إن أنسجة المشيمة والأجنة تظهر فيها نسبة إصابة منخفضة نتيجة تعرضها للتلف أو للتحلل الذاتي مما يقلل من فرصة تشخيصها بصورة صحيحة (Collantes et al., 2006) ، بينما بينت دراستنا أن نسبها عالية نتيجة التعامل المباشر والاني مع العينة دون اللجوء إلى حفظها ومعاملاتها بعد فترة زمنية من الحفظ ، فيما بين آخرون (Wisniewski et al., 2002) ، أن نسبة الإصابة تکون متباينة حسب موقع المشرع ونوعه حيث تبين أن المشرع للجين Nc5 يکون ذو حساسية عالية للکشف عن هذا الطفيلي نتيجة عدم تواجده في الاوالي التي تمتلک علاقة مستضدية مع البوغة الجديدة الکلبية(Toxoplasma gondii, Sarcocystis SPP, Hammondoia hammondi) ،مما يرفع من دقة التشخيص.

وأظهرت النتائج عدم حصول نمو في عينات الدم للعجول وکذلک تواجد الطفيلي بنسب منخفضة في دم الأبقار، وقد يعود السبب في ذلک إلى مرحلة تطور وانتقال الطفيلي داخل الثوي المتوسط ،حيث أنه يکون بأعداد کبيرة في مرحلة الطفيليمية دون المراحل الأخرى مما يؤثر على نسب الإصابة (Aline et al., 2009) ، وبينت النتائج کذلک وجود الدنا للطفيلي في المزارع الخلوية بنسب عالية ومرتفعة، وقد يعود السبب في ذلک لاستخدامنا أکثر من مشرع للکشف عن ذراري البوغة الجديدة الکلبية ، وهذا يختلف عن ما ذکره (Salehi et al., 2009) ،حيث کانت النسبة منخفضة نتيجة لاستخدامه نوع واحد من المشرعات ، وقد فسر سبب النسب المنخفضة من قبل باحثين آخرين (Medina, 2006) ، باستخدام المشرع ITS1 والذي يمتلک حساسية أقل مما هو عليه حال بالنسبة للذي يتمتع به المشرع Nc5.

بينت نتائج هذه الدراسة العلاقة ما بين الأعراض المرضية و عدد العينات الايجابية لکل من المزارع الخلوية وتفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي، حيث أن هناک تباينا" ما بين المجاميع ، حيث بينت نتائج الفحص للأجنة المجهضة أن أعلى نسبة إصابة لکلا الطريقتين کانت في الأجنة التي اجهضت في (الثلث الثاني) ، وقد يعود السبب في ذلک إلى أن الأجنة في الثلث الأول من الحمل في حال کونها مصابة تکون الإصابة في بداية تکونها وعدد الحيوانات التسرعية فيها قليلا ، في حين أن الأجنة في الثلث الأخير من الحمل تکون الحيوانات التسرعية في أنسجتها قليلة نتيجة قابلية جهازها المناعي لتکوين استجابة مناعية ، بالإضافة إلى الاستجابة المناعية لأجساد أمهاتها مما قد يقلل من تکاثر وانتشار الطفيلي في أنسجتها (Corbellini, 2002) ،أما العجول فکانت أعلى نسبة إصابة في تلک التي أظهرت عدم قدرتها على النهوض مع أعراض تظهر فشلا عضليا وعصبيا،  وقد يعود السبب في ذلک لظهور أعراض على هذه العجول ناجمة عن إصابة بالبوغة الجديدة الکلبية فضلا عن ضعف النمو في أجسادها مما قد يساعد في انتشار وتقدم الإصابة (Hemphill et al., 2000) ، أما عند الأبقار فلوحظ أن أعلى نسبة إصابة کانت في أبقار التي أجهضت (الثلث الثاني من الحمل) ، وقد يعود السبب في ذلک إلى دور الإصابة المزمنة حيث أن الإصابة تنشط نتيجة تحطم الأکياس النسجية وتحول الحيوانات البطيئة إلى الحيوانات التسرعية نتيجة لعملية تسمى (Bradyzoites-to-Tachyzoites Reconversion) ، وذلک نتيجة أي خلل في الجهاز المناعي أو الحمل،  وإن إعادة تنشيط الإصابة المزمنة يأخذ فترة من الزمن مما قد يقلل من فرصة حدوث الإجهاض في الثلث الأول من الحمل نتيجة الإصابة بالبوغة الجديدة الکلبية (Guy et al., 2001) ، في حين أن الثلث الأخير من الحمل تقل فيه نسبة الإصابة نتيجة للاستجابة المناعية والتي تقلل من أعداد الحيوانات التسرعية في المشيمة (Bergeron et al., 2000).

وقد بينت نتائج الکشف عن أنواع الذراري المعزولة في خلايا الزرع الخلوي والتي جرى الکشف عنها وتصنيفها باستخدام ثلاثة أزواج من المشرعات للذراري (NC-5،Nc1،BPA4) ، باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي وجود تباين في نسب تواجدها في الأعضاء والحيوانات حيث کانت أعلى نسبة للذرية NC-5 في عينات الأبقار التي تم العزل منها،  في حين سجلت الذرية BPA4 أعلى نسبة إصابة  لکل من العجول والأجنة، إن هذا التباين يعود لعدد أسباب منها،الاختلاف في ضراوة الذراري المسببة للإصابة حيث إن الدراسات لم تثبت إلى حد ألان مدى ضراوة جميع الذراري للبوغة الجديدة الکلبية في الأبقار،وذلک نظرا للکلفة المادية العالية لإجراء ذلک فيما عدا استخدام الحيوانات المخبرية بالإضافة إلى أن للبوغة الجديدة الکلبية قابلية لإصابة أعضاء دون الأخرى ، لکل ذرية حسب خصائصها الحيوية (البيولوجية) والجينية، لذلک فان نسب انتشارها وتواجدها في الأعضاء تکون متباينة (Al-Qassab et al., 2010) ، فيما ذکر آخرون (Alexander et al., 2011) ، أن ذراري البوغة الجديدة الکلبية التي تصيب الکلاب تصيبب الأبقار على حد سواء .

وقد أکد (Sager, 2001) أن تشخيص البوغة الجديدة الکلبية يتطلب استخدام أکثر من اختبار، ويتعلق ذلک بمبدأ الحساسية والنوعية للتشخيص .

REFRENCES

المصــادر

Alexandre, D.M.; Ana, P.P.J. and Rosangela, Z.M. (2011):Bovine abortion Associated with Neospora caninum : Diagnosis and Epidemiological Aspects of a dairy cattle herd in the Northeast region of Sao Paulo State, Brazil. Brazilian Journal Of Veterinary Parthology, 4(2): 112-116.

Aline, D.C.; Clarice, N.C.; Nara, T.C.; Liria, H.O.; Edviges, M.P. and Claudia, D.F. (2009): Diagnosis of Neospora caninum in bovine fetuses Histology, immunohistochemistry, and nested –PCR.Rev Bras Parasitol. Vet., 18(4): 14-19.

Al-Qassab, S.E.; Michael, P.R. and John, T.E. (2010): On the biological and Genetic diversity in Neospora caninum. Diversity, 2: 411-438.

Bergeron, N.; Girard, C.; Pare, J.; Fecteau, G.; Robinson, J. and Baillargeon, P. (2000): Rare detection of Neospora caninum in placentas from Seropostive dams giving birth to full-term calves. J. Vet. Diag Invest, 13: 1169-172.

Bjerkas, I.; Mohn, S.F. and Piesthus, J. (1984): Unidentified cyst –forming Sporozoan causing Encephalomyelitis and Myocystitis in dogs. Z Parasitinkd, 70: 271-274.

Collantes, F.E.; Rodriguez, B.A.; Arnaiz, S.I.; Moreno, B.; Aduriz, G. and Ortega, L. (2006): Influence of the stage of pregnancy on Neospora caninum Distribution parasite loads and lesion in aborted bovine fetuses. Theriogenology, 10: 629-641.

Corebellini, L.C. (2002): Neosporosis as acause of abortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul, Southern braail. Veterinary Parasitology, 103(3): 195-202.

Dubey, J.P.; Schares, G. and Ortega-Mpra, L.M. (2007): Epidemiology and control of neosporosis and Neospora caninum. Clinical Microbiology Review, 20(2): 323-367.

Esther, C.F.; Angel, Z.; Gema, A.G. and Luis, M.O. (2002): Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimental Infected Mice by Real-Time PCR. Journal of Clinical Microbiolog, 40(4): 1194-1198.

Gozdzik, K. and Cabaj, W. (2007): Characterization of the first Polish isolate of Neospora caninum from cattle. Acta Parasitologica, 52: 295-297.   

Guy, C.S.; Williams, D.J.L.; Kelly, D.F.; McGarry, J.W.; Guy, F.; Bjorkman, C.; Smith, R.F. and Trees, A.J. (2001): Neospora caninum in persistently Infected  pregnant cows spontaneous transplacental infection is Associated: with an acute increase in maternal antibody. Vet. Rec., 149: 443-453.

Habibi, G.R.; Hashemi, F.R.; Sadrebazzaz, A.; Bozorgi, S. and Bordbar, N. (2005): Seminested PCR for diagnosis of Neospora caninum infection in Cattle. Arch Razi Ins, 59: 55-64.

Hemphill, A.; Gottstein, B. and Conraths, F.J. (2000): A European perspective on Neospora caninum. Int. J. Parasitol, 30: 877-924.

Jessica, S.K.; Bronwyn, M.; Derek, S.S.; Scott, A.L.; Lada, H.H.; Ashile, H.; Sarwat, E.L.; John, T.E. and Jan, S. (2011): Extensive production of Neospora caninum tissue cysts in a carnivorous marsupial Succumbing to experimental neosporosis.Vet. Res., 42(1): 75-86.

Katarina, R.; Silvia, S.; Andrea, C. and Rastislav, M. (2011): First in vitro Isolation of Neospora caninum from naturally infected adult dairy Cow in Slovakia. Acta Parasitologica, 56(2): 111-115.

Masumi, S.; Hisayo, K.; Yukiko, T.; Chun-Ho, P.; Takehito, M.; kinori, S.; and Takashi, U. (2000): Isolation of Neospora caninum from The brain of a naturally infected adult dairy cow. Veterinary Parasitology, 90: 247-252.

Medina, L. (2006): Survey of Neospora caninum infection by nested PCR in Aborted fetuses from dairy farms in Aguascalientes, Mexico. Veterinary Parasitology, 136(4): 187-191.

Nathalie, V. (2003): Hiding inside the host: Development and application of Neospora caninum bradyzoites in vitro culture. PhD Thesis, University of Basel, Germany, PP: 29-34.

Norbert, M.; Nathalie, V.; Christian, G.; Stephen, L.L. and Andrew, H. (2002): Application of Real-Time fluorescent PCR for Quantitative Assessment of Neospora caninum infections in organotypic Slice cultures of rat central nervous system tissue. J. Clinic Microbiology, 40(1): 252-255.

Okeoma, C.M.; Williamson, N.B.; Pomroy, W.E.; Stowell, K.M. and Gillespite, L.M. (2004): Isolation and molecular characterization of Neospora caninum In cattle in New Zealand. New Zealand Veterinary Journal, 52: 364-370.

Rai, A. (2008): Laboratory manual of cell culture and animal virology, Indian Veterinary research Institute, India, PP: 8-12.

Sager, H. (2001): A Swiss case –control study to assess Neospora caninum Associated bovine abortions by PCR, histopathology and serology. Veterinary Parasitology, 102(1): 1-15.

Salehi, N.; Haddadzadeh, H.; Ashrafihelan, J.; Shayan, P. and Sadrebazzaz, A. (2009): Molecular and pathological study of bovine aborted fetuses And placenta from Neospora caninum infected dairy cattle. Iranian J. Parasitol, 4(3): 40-51.

Sawada, M.; Kondo, H.; Tomioka, Y.; Park, C.H.; Morita, T.; Shimada, A. and Umemura, T. (2000): Isolation of Neospora caninum from the Brain a naturally infected adult dairy cow. Veterinary Parasitology, 90: 247-252.

Timothy, V.B.; Lawrence, J.C.G.; Maureen, T.L. and Bruce, A.M. (1999): Detection by PCR of Neospora caninum in fetal tissue from Spontaneous bovine abortions. Journal of Clinical Microbiology, 37(12):4059-4064.

Yamane, I.; Kokuho, T.; Shimura, K.; Eto, M.; Shibahara, T.; Haritani, M.; Ouchi, Y.; Sverlow, K. and Conrad, P.A. (1997): In Vitro isolation and Characterization of a bovine Neospora Species in Japan. Res. Vet. Sci., 63: 77-80.

Wisniewski, M.; Cabaj, W.; Moskwa, B. and Wedrychowicz, H. (2002): The First detection of Neospora caninum DNA in brains of calves in Poland. Acta Veterinaria, 52(6): 393-400.