DETECTION OF CLOSTRIDIUM CHAUVOEI EFFECT ON COWS CARCASSES MEAT IN MIDDLE REGION'S SLAUGHTERHOUSES IN SYRIA

قسم أمراض الحيوان جامعة البعث – سورية

Detection of Clostridium chauvoei effect on cows carcasses meat in middle region's slaughterhouses in Syria

(With 4 Tables and 4 Figures)

By

الکشف عن تأثير الإصابة بمطثية شوفاي على لحوم الأبقار في مجازر المنطقة الوسطى من سورية

مازن حسان الصحن ، ياسين عبد الله الياسينو* ، عبد العزيز عروانة**

* قسم أمراض الحيوان جامعة البعث – سورية

** قسم الصحة والطب الوقائى جامعة البعث – سورية

(Received at 15/11/2009)

تم من خلال هذا البحث الکشف عن تأثير الإصابة بمطثية شوفاي (مرض القائمة السوداء) على لحوم الأبقار في مجازر المنطقة الوسطى من سورية من حيث جودة اللحوم وصلاحيتها للاستهلاک البشري وقرار فحصها. حيث أجري البحث على عينات من ذبائح أبقار مشتبه بإصابتها بالمرض في مجزر محافظة حماة وکان عددها (35) عينة, وعينات من ذبائح أبقار مشتبهة أخرى في مجزر محافظة حمص وکان عددها (25) عينة. وعينات أخرى من مجزر مدينة الرستن التابعة لمحافظة حمص کان عددها (15) عينة وتم عزل العامل المسبب للمرض (جراثيم مطثية شوفاي) من مجزر حماة في عينة واحدة فقط بينما لم نحصل على أي عزولة إيجابية في مجزري حمص والرستن. کما تم إجراء اختبار الحساسية لثماني صادات الحيوية على العزولات الإيجابية لتحديد نوع الصاد الحيوي المناسب لعلاج الإصابة بمرض الجمرة العرضية.

SUMMARY

In this study, the effect of black leg disease was detected on cattle's meat in middle region's slaughterhouses in Syria at which meat's goodness and its suitability for human's use and its inspection decision were evaluated. This research was applied on samples from cattle carcasses (75) suspected to be infected by black leg disease in Hama's slaughterhouse (35) samples, Homs's slaughterhouse (25) samples, and Rastan's slaughterhouse which appendant to Homs (15) samples. The pathogenic agent (Clostridium chauvoei) was isolated from Hama's slaughterhouse only in one sample while in Homs and Rastan slaughterhouses we haven't any positive sample. The sensitivity test for eight antibiotics on positive sample to delimit the suitable antibiotic to treat black leg disease was carried out.

Introduction

المقدمة

تعتبر المطثيات من المنظور التطوري أولى الجراثيم المتواجدة على کوکب الأرض حيث أنه قبل حوالي 2.7 بليون سنة قبل التکون الأولي للأوکسجين ظهرت المطثيات کصنف بارز بين الجراثيم.(Johansson, 2006) يعتبر العالم بولينجرBollinger  عام (1875) هو أول من وصف مطثية مرضية وهي مطثية شوفاي Clostridium chauvoei ثم توال توصيف الأنواع الأخرى (Johansson, 2006). يعرف مرض الجمرة العرضية (مرض القائمة السوداء) بأنه مرض معدي حاد وبائي تسببه جراثيم مطثية شوفاي     Clostridiumchauvoeiيصيب الأبقار وأحيانا الماعز والجاموس ويتميز بتشکل وذمة غازية في المناطق العضلية السميکة (عضلات الرقبة والفخذ والکفل ...) مصحوبة بصوت قرقعة بالضغط عليها , هذا الصوت يعزى إلى وجود الغاز الذي ينتج من قبل الجراثيم المتواجدة في العضلات المصابة (Floyd and James, 1994) .

وأشار الباحثان (Smith and Holdeman)عام (1968) إلى أن العدوى عند الأبقار تنتقل عن طريق تناول العلف أو الشراب الملوثين بالعامل المسبب ويساعد على ذلک وجود الجروح في الفم أو التقرحات في الغشاء المخاطي المبطن للمعدة والأمعاء الناتجة عن الطفيليات الداخلية ونادراُ ما تحصل العدوى عن طريق الجروح الخارجية في الجلد.

وجد الباحثان (Wierup and Sandstedt, 1983) أن معدل الإصابة بمرض القائمة السوداء يزداد في المزارع التي تستخدم نظام الحلمات في الري وکذلک نظام الري عن طريق الآبار وأيضاً بعد حدوث الفيضانات حيث ترتفع الأبواغ والبذيرات إلى سطح التربة نتيجة لذلک , ويظهر هذا جلياً في الموسم الصيفي الجاف الذي يليه حيث تکون الأعشاب قصيرة الطول مما يسمح للأبقار التي ترعى في تلک المزارع أن تتناول البذيرات وبالتالي حدوث العدوى.

إن جراثيم مطثية شوفاي هي جراثيم إيجابية الغرام  تکون على شکل عصيات يبلغ طولها (2-8) ميکرومتر وعرضها (0,6 – 1) ميکرومتر تنتظم بشکل إفرادي أو مزدوج فقط , وهي متبوغة حيث تتوضع البوغة بشکل مرکزي أو تحت نهائي تعطي العصية شکل الليمونة ويتعدى قطر البوغة قطر العصية , وتحتاج عصيات مطثية شوفاي إلى ظروف لاهوائية شديدة الإحکام ويحتاج نموها إلى بيئات غذائية غنية جداُ (أغار کبدي مدمم بدم الأغنام) وهذا ما أشار إليه الباحثون (Sutter, et al., 1985).

وأکد الباحث (Ryden, 1958) أنه عندما يتناول الحيوان العامل المسبب ينتقل مع الدم إلى العضلات ويستقر فيها مفرزاً ذيفاناً ومنتجاً غازات مؤدياً بذلک إلى وذمة غازية إلتهابية التي تنتقل خلال وقت قصير إلى مجموعة کبيرة من العضلات السميکة.

غالباً ما تصاب العجول والأبقار والثيران في المراعي بعمر ستة أشهر وحتى الثلاث سنوات وذلک نتيجة لتبديل الأسنان خلال هذه المرحلة من العمر وبالتالي تصبح اللثة المجروحة مدخلاً للجراثيم ويعزى عدم إصابة العجول دون الستة أشهر من العمر إلى المناعة المکتسبة التي حصلت عليها هذه العجول من أمهاتها عن طريق اللبأ (السرسوب) وهذا ما أشار إليه الباحثان (Smith and Williams, 1984).

أثبت الباحث الألماني (Beer, 1987) أن فترة حضانة مرض القائمة السوداء تتراوح من (1- 3) أيام تظهر بعدها أعراض المرض فجأةً.

عند فتح مکان العضلة المصابة في الحيوان النافق يلاحظ فيها تعفنات مع اسوداد لون العضلات في تلک المنطقة إضافة لوجود جيوب غازية بينها ذات رائحة حمضية لاذعة تشبه رائحة الزبدة الفاسدة وهذا ما أشار إليه الباحث (Acha and Szyfries, 1987).

الهدف من البحث:

1-      تحديد معدل الإصابة بمرض الجمرة العرضية في الذبائح الواردة إلى مجازر المنطقة الوسطى.

2-      معرفة أفضل أنواع الصادات الحيوية التي تؤثر على المستعمرات الجرثومية المعزولة من العينات الايجابية التي تم عزلها وتصنيفها.

Materials and Methods

مواد وطرائق البحث

تم البحث والتقصي عن ذبائح أبقار مشتبه بإصابتها بمرض الجمرة العرضية في المجازر الموجودة في محافظتي (حمص وحماة) في الفترة الواقعة بين شهر نيسان عام 2008 وشهر آذار 2009. فقد أخذت عينات من لحوم الفخذ والرقبة للحيوانات المذبوحة المشتبه بإصابتها بمرض الجمرة العرضية لتحديد فيما إذا کانت مريضة , وعزل العامل المسبب منها.

بلغ عدد العينات المفحوصة المشتبهة في مجزر حماة (35) عينة , وفي مجزر حمص (25) عينة وفي مجزر مدينة الرستن التابعة لمحافظة حمص (15) عينة أي بلغ عدد العينات المفحوصة الکلي في مجازر المحافظتين (75) عينة. علماً أنه حصلنا على عينتين إيجابيتين من خارج نطاق المجازر ضمن مزارع التربية الخاصة والحقول في المحافظتين وذلک مذکور في جزء آخر من بحثنا.

تم فحص الأعراض السريرية للحيوان قبل الذبح حيث لاحظنا: * ارتفاع في درجة الحرارة 40 * 42 درجة مئوية * انتفاخ وتوذم في منطقة العضلات السميکة * سماع صوت قرقعة عند الضغط على مکان الإصابة * عند فتح الجلد تخرج روائح کريهة تشبه رائحة الزبدة الفاسدة * تضخم العقد اللمفاوية المأخوذة من مکان الإصابة.

أخذت العينات بعد الذبح مباشرة من مکان الإصابة بواسطة مقص ومشرط عقيمين تماماً ووضعت في عبوات بلاستيکية عقيمة ومغلقة تماماً ثم وضعت في حافظة بشروط عقيمة ونقلت بشکل صحي وسليم إلى المخبر.

تم تجهيز المواد والأجهزة اللازمة لإجراء العزل الجرثومي في المخبر بشکل صحي وعقيم (شرائح زجاجية – لوب - مقصات – مشارط- مجهر- أدوات زجاجية معقمة – أطباق بتري – غرفة زرع جرثومي خاصة – حضانة جرثومية – مصدر لهب حراري (غاز) – ميزان الکتروني حساس وغيرها).

بعد جمع العينات (من اللحوم المشتبه بإصابتها وخاصةً في المناطق العضلية السميکة / الکتف , الفخذ /) , تم زرعها على منبت الآجار المدمم بدم الأغنام الذي يتکون من المرکبات التالية: (Sodium chloride 5 gm-Agar 15 gm Beef heart infusion 500 gm - Tryptose10 gm -). وحضنت الأطباق بدرجة حرارة (37) مئوية        لمدة (48) ساعة في وسط لا هوائي شديد الإحکام ضمن جهاز الزرع اللاهوائي , وبعد الحضن سجلت النتائج وتمت مشاهدة المستعمرات الجرثومية النامية المميزة لمطثية شوفاي  (Clostridium chauvoei).

أخذت مستعمرة مفردة من المستعمرات النامية على منبت الآجار المدمم وزرعت في وسط (مرق الکبد تاروزي) التمييزي لمطثية شوفاي وحضنت الأطباق في وسط لا هوائي شديد الإحکام بالدرجة(37) مئوية لمدة (48) ساعة وتم تسجيل لون المستعمرات وشکلها وحجمها.

تم إجراء الفحص المجهري للجراثيم المأخوذة من المنابت بعد صبغها بصبغة غرام المحضرة مخبرياً, ومشاهدة الخواص الشکليائية للجراثيم المعزولة.

ثم أخذت مسحات من المستعمرات الموجودة في المنابت السابقة والتي کانت إيجابية وزرعت على منبت آجار موللر هينتون Mueller- Hinton Agar المستخدم في اختبار الحساسية للجراثيم تجاه الصادات الحيوية.

Results

النتائج

وجدت مطثية  شوفاي في عينة واحدة من أصل (35) عينة أخذت من أبقار مشتبه بإصابتها بمرض الجمرة العرضية في مسلخ محافظة حماة الجدول رقم (1). ولم توجد في أي عينة إيجابية من العينات المشتبه بإصابتها بمرض الجمرة العرضية في مسلخ محافظة حمص الجدول رقم (2).

کما أنه لم توجد أي عينة إيجابية من العينات المشتبه بإصابتها بمرض الجمرة العرضية في مسلخ مدينة الرستن الجدول رقم (3).

يبين الجدول رقم (1) عدد العينات المأخوذة من مجزر محافظة حماة وجنس الحيوانات المذبوحة وأماکن أخذ العينات من الذبائح وتاريخ أخذ العينات ونتائج الفحص المخبري لمرض الجمرة العرضية لتلک العينات.

يبين الجدول رقم (2) عدد العينات المأخوذة من مجزر محافظة حمص وجنس الحيوانات المذبوحة وأماکن أخذ العينات من الذبائح وتاريخ أخذ العينات ونتائج الفحص المخبري لمرض الجمرة العرضية لتلک العينات.

يبين الجدول رقم (3) عدد العينات المأخوذة من مجزر مدينة الرستن وجنس الحيوانات المذبوحة وأماکن أخذ العينات من الذبائح وتاريخ أخذ العينات ونتائج الفحص لمخبري لمرض الجمرة العرضية لتلک العينات.

کان تأثير مطثية شوفاي على ذبيحة الحيوان المصاب مترکزة في منطقة الفخذ (العضلات السميکة) وکانت الأعراض الظاهرة على الحيوان قبل الذبح کما يلي:

1-      ارتفاع في درجة حرارة جسم الحيوان إلى (41) درجة مئوية , مع برودة في مکان الإصابة.

2-    بالضغط على مکان الإصابة نسمع صوت قرقعة.

3-     انتفاخ وتوذم في منطقة الفخذ مکان الإصابة.

أما التغيرات المرضية التي کانت على اللحم بعد الذبح فقد کانت کالتالي :

1-      خروج رائحة کريهة بعد فتح الجلد مکان الإصابة تشبه رائحة الزبدة الفاسدة.

2-      اسوداد لون اللحم مکان الإصابة. (الشکل رقم 1).

3-      تشکل سوائل التهابية وغازات مکان الإصابة. (الشکل رقم 1).

4-      تضخم العقد اللمفاوية الموضعية وارتشاحها بسوائل التهابية. (الشکل رقم 2).

يبين الشکل رقم (1) اسوداد اللحم مکان الإصابة في فخذ الحيوان المصاب وتشکل سوائل التهابية

يبين الشکل رقم (2) تضخم العقد اللمفاوية المأخوذة من مکان الإصابة

کانت نتيجة الزرع الجرثومي على منبت الآجار المدمم عبارة عن مستعمرات جرثومية مميزة لمطثية شوفاي محللة للدم على نطاق ضيق کما هو موجود قي الشکل رقم (3) .

يبين الشکل رقم (3) المستعمرات المتشکلة على منبت الآجار المدمم وأماکن التحلل الدموي.

بعد إجراء المسحة الجرثومية وصبغها بصبغة غرام تمت مشاهدة الجراثيم وصفاتها الشکليائية تحت المجهر على شکل عصيات مفردة إيجابية الغرام کما هو موجود في الشکل رقم (4).

يبين الشکل رقم (4) عصيات المطثية شوفاي الإيجابية الغرام المفردة

بعد إجراء زرع العينات الإيجابية على آجار موللر هينتون              (Mueller Hinton Agar) وإجراء اختبار حساسية للجراثيم المعزولة من العينات الإيجابية المأخوذة  ضمن المجازر وخارجها والتي کان عددها (3) عزولات إيجابية من أصل (200) عينة مشتبهة بالإصابة بالمرض وکان من ضمنها عينة واحدة إيجابية فقط في مجزر مدينة حماة , وکما ذکرنا سابقاً أن عدد العينات المشتبهة والمأخوذة من المجازر کانت (75) عينة. وقد أجري الاختبار على الصادات الحيوية التالية :

کانت نتائج الاختبار على العينات الإيجابية الثلاثة حسب منطقة منع النمو کما يلي وفق الجدول رقم (4):

يبين الجدول رقم (4) نتائج اختبار الحساسية للصادات الحيوية على العزولات الإيجابية التي حصلنا عليها من کلتا المحافظتين حمص وحماة.

+++ : منطقة منع نمو جرثومي جيدة      ++ : منطقة منع نمو جرثومي متوسطة                  + منطقة منع نمو جرثومي ضعيفة           ± : اشتباه بمنطقة منع نمو جرثومي       

- : لا يوجد أي تأثير

DISCUSSION

المناقشة

جمعت العينات اعتماداً على أعراض المرض السريرية من توذم وانتفاخ وسماع صوت طقطقة عند الضغط على مکان الإصابة وخروج رائحة کريهة مکان فتح الجلد تشبه رائحة الزبدة الفاسدة وهذا ما يتوافق مع الباحث (Forbes andSahm, 1998).

من خلال نتائج الجدول رقم (1) تبين لنا أن جنس الحيوان المصاب کان ذکراَ وأن هذه النتيجة کانت متطابقة مع نتائج الباحثين (Schipper, et al., 1978) حيث تبين لديهم أن نسبة الإصابة عند ذکور التسمين أکبر من الإناث.

أيضاَ من خلال الجدول رقم (1) وجدنا أن الإصابة بمرض الجمرة العرضية ترکزت في الأشهر الحارة من السنة (تموز وآب) وهذا ما يتوافق مع الباحث      (Walker. 1990).

مما سبق وکما ورد وفق الجدولين (2) و(3) وجدنا أن مجازر محافظة حمص ومدينة الرستن لم يرد إليهما أي إصابة خلال فترة إجراء البحث وهذا ربما يعود إلى فروقات المناخ وطبيعة التربية وطريقتها بين المحافظتين , وهذا ما أکده الباحثون   (Munangandu, et al., 1996) فقد أشاروا إلى أن الإصابة ترکزت لديهم في مدينة دون الأخرى ووجدوا أن المدينة التي حصلوا فيها على إصابات بمرض الجمرة العرضية کانت تعتمد في تربيتها للأبقار على التربية الطليقة في المراعي أکثر منها في التربية المقيدة ضمن الحظائر.

من خلال دراستنا وجدنا أن معدل الإصابة بمرض الجمرة العرضية (القائمة السوداء) في مجازر المنطقة الوسطى خلال فترة إجراء البحث کان(1/75) أي عينة واحدة إيجابية من أصل (75) عينة مشتبهة بالإصابة بمرض الجمرة العرضية. بينما وجد الباحثون (Azechi, et al., 1962)أن معدل الإصابة في مجزري المدينتين اللتين أجري البحث فيهما کانت (4%).

إن العامل المسبب للمرض يتواجد في التربة لعدة سنوات , وعند تناول الحيوانات للأعشاب الملوثة بالأبواغ (البذيرات) فإن العامل المسبب ينتقل من الأمعاء عبر الدم إلى المناطق العضلية السميکة حيث يستقر فيها حتى تصبح الظروف ملائمة للتکاثر الجرثومي وإحداث المرض عن طريق إنتاج الذيفانات التي تؤدي إلى إنتاج الغازات وسوائل التهابية مکان الإصابة واسوداد النسيج العضلي وهذا ما أکده الباحثون                      (Dwight and Yuan,1999).

تعتبر اللحوم المصابة بمرض الجمرة العرضية غير صالحة للاستهلاک البشري لأنها تعتبر لحوم حمية دموية حيث تؤدي إلى التهابات معوية عند الإنسان وإسهالات وتسممات, لذا فإن القرار الصحي لمعاملة هذا النوع من الذبائح هو إعدام الذبيحة کلياً وهذا ما يتطابق مع الباحثان (Gakuen and Musashi, 2004).

وبالتالي تأثيره السلبي ليس فقط على المستهلک وإنما أيضاً على الجانب الاقتصادي الناتج عن الخسائر المادية والبروتينية بسبب هذا الإتلاف لهذه الحيوانات والذبائح.

أما الباحث الألماني (Horsch,1990) فقد أثبت أن التغيرات المشاهدة في الطحال والأعضاء الأخرى قليلة لکنه في بعض الأحيان تشاهد تجمعات جافة صفراء بحجم حبة البازلاء في الکبد والکلى. تتضخم العقد اللمفاوية وترتشح بمصل مدمم ويشاهد التهابات فبرينية في التامور والجنبة إضافة إلى اسوداد عضلات القلب واللسان والحجاب الحاجز. وهذا ما تطابق تماما ً مع نتائج بحثنا.

وجدنا من خلال اختبار الحساسية أن جراثيم مطثية شوفاي لديها مقاومة للصادات الحيوية التالية (الکوليستين , والجنتاميسين , الستريبتومايسين) حيث أنه لم تتشکل منطقة منع نمو جرثومي وهذا ما أشار إليه الباحثون (Yang Sool Chang, et al., 2001) فقد وجدوا أن العزولات التي حصلوا عليها لم تتحسس للصادات الحيوية المذکورة.

کما تبين لدينا من خلال اختبار الصاد الحيوي على العينات الجرثومية المعزولة أنها کانت حساسة بشکل کبير للبنسلين حيث تشکلت منطقة منع نمو جرثومي کبيرة وواضحة حول القرص الحاوي على البنسلين , في حال أن (التتراسيکلين والسيبروفلوکساسين) أعطت مناطق منع نمو جرثومي تعتبر جيدة نوعاً ما ولکنها أقل من البنسلين والأمبيسلين وهذا ما أکده أيضاً الباحثون (Yang Sool Chang, et al., 2001).

إن القرار الصحي للعينات أو الحيوانات المصابة الواردة إلى المجزر هو الإتلاف الکلي للذبيحة وهذا ما يؤدي إلى خسائر اقتصادية وبروتينية کبيرة بالنسبة للمربي والمجتمع وهذا ما أکده الباحثون (Kuhnert, et al., 1997) فقد وجد أن معدل الإصابة في البلد الذي أجروا فيها بحثهم إضافة إلى القرار الصحي لتفتيش لحوم الحيوانات المصابة من إتلاف کلي للذبائح المصابة يؤدي إلى خسائر اقتصادية وبروتينية کبيرة.

Conclusions and Suggestions

الاستنتاجات والمقترحات

1 - يعتبر مرض الجمرة العرضية من الأمراض التي تؤثر على صحة المستهلک والذي يکون قرار تفتيش اللحوم المصابة به هو الإتلاف الکلي للذبيحة المصابة , وهذا ما يؤدي إلى خسارة مادية وبروتينية حيث يقاس تطور بلد ما بمقدار استهلاک الفرد فيه للبروتين الحيواني.

2 - يتجلى تأثير الإصابة بمرض الجمرة العرضية عند الأبقار على اللحوم في المناطق العضلية السميکة للذبيحة , حيث تعتبر تلک الأجزاء من الذبيحة من أفضل اللحوم التي يرغبها المستهلک فتصبح نتيجة الإصابة سوداء اللون وذات رائحة کريهة وغير صالحة للاستهلاک البشري.

3 - يعتبر البنسلين من أفضل المضادات الحيوية المستخدمة في علاج المرض بشرط أن يتم العلاج في المراحل الأولى من المرض , أي أن تشخيص المرض بشکل سريع ضمن الحقل عند الاشتباه بحدوث الإصابة يعطي نتيجة علاجية إيجابية أکثر.

المقترحات:

1 - مراعاة تطبيق قواعد الصحة العامة ضمن المجازر من خلال الصحة الشخصية والتعقيم والتطهير خصوصا ً عند التعامل مع أمراض ذات خطورة على صحة الأفراد مثل مرض الجمرة العرضية.

2 - التخلص الصحي التام من جثث الحيوانات المصابة والنافقة بمرض الجمرة العرضية وذلک بسبب قدرة العامل المسبب على البقاء لعدة سنوات مع الاحتفاظ بقدرته على الخمج ضمن التربة.

3 - تطبيق برامج الوقاية واللقاحات المعتمدة بشکل محکم لمکافحة مرض الجمرة العرضية, وتوعية مربي الأبقار والعجول إلى أهمية تلک اللقاحات في الوقاية من حدوث مرض الجمرة العرضية.

4 - اتخاذ الإجراءات الضرورية للحد من الآثار الضارة للفيضانات والسيول والسيطرة على عوامل انتشار العامل المسبب للمرض.

References

Azechi, H.; Seto, K.; Mukawa, K. and Suzuki, K. (1962):Studies on the potency test of blackleg vaccine. Jpn. J. Vet. ci 24: 267-275.    

Acha, PN. and Szyfries, B. (1987):Zoonoses communicable diseases common to man and animals, 2^nd ed, Pan America Health organisation, Washington.

Beer, J. (1987):Infekhonskrankheiten der Haustiere. 3; Auflage, VEB Gustav Fischer Verlage Jena.     

Dewight, C.H. and Yuan, C.Z. (1999):Veterinary Microbiology, black well science. inc. Usa. pp. 233-245.

Floyd, G. and James, J. (1994): Black leg and other clostridial diseses in cattle Alabama Cooperative Extension System. ANB -0888. Auburn, Alabama.

Forebes, B.A. and Sahm, D.F. (1998): Weissfeld bacteriology laboratory considerations in: Bailey and scott's diagnostic microbiology. 10 th ed. st Louis.     

Gakuen, and Musashi, M. (2004): Department of bacterial pathogenesis and infection control, National institute of infectious diseases, Tokyo 208- 0011, japan.

Horsch, F. (1990): Immunprophylaxe bei Nutzitieren. Gustav Fischer Verlag Jena.

Johansson, A. (2006): Clostridium perfringes the causal agent of necrotic enteritis in poultry doctoral thesis; Sweedish University of Agrycultural Sciences. pp; 12-14.       

Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capul, SE.; Frey, J. and Nicolet, J. (1997): Identificationof clostridium chauvoei in cultures and clinical material from black leg using PCR. Vet Microbial 57:        291–298.   

Munang'andu, HM.; Muyoyeta, PM.; Mweene, AS. and Kida, H. (1996):   Bovine clostridial infections in Zambia. Jpn J. Vet. Res. 44: 175-178.          

Ryden, R. (1958): Development of anaerobic fermentation processes: acetone- butanol. In biochemical Engineering ed. Steel J.R –pp.123-128. London: Heywood.

Schipper, IA.; Kelling, CL. and Mayer, J. (1978): Effect on immune response in calves vaccinated against Clostridium chauvoei  infection (Blackleg). Vet. Ret. 100: 90-91.

Smith, L.D.S. and Williams, B.L. (1984):Clostridiumchauvoei. In the pathogenic anaerobic bacteria 3th edn, pp 164-175 Springfield: Charles C. Thomas.        

Smith, L.D.S. and Holdeman, L.N. (1968): Clostridium chauvoei, In the pathogenic anaerobic bacteria pp, 361-373. Springfield: Charles C. Thomas.

Sutter, V.L.; Citron, D.M.; Edelstein, M.A.C. and Fine gold, S.M. (1985): Wadsworth anaerobic bacteriology Manual.4^th edition. Star, BelmontUSA.                                                   

Wierup, M. and Sandstedt, K. (1983): Blackleg and pulpy kidney disease –two clostridim diseases in Sweden, 35: 23-24 (In Sweedish).                                                         

Walker, P.D. (1990): Clostridium, in Carter and J.R. Cole ,J.R (ed) .Diagnostic procedures in Veterinary bacteriology and mycology, 5^th ed. Academic press, San. Diego., Calif.; P.      229-251.                                      

Yang Sool Chang; Kyoo Tae Kim; Young Hoan Kim; SoonTae KiM; Jae Cheul Do; Dae Won Kim and Bong Hwan Kim (2001): Prevalence and factors associated with Blackleg outbreak in north western Gyeongbuk province. Korean J. Vet. Serv. 25 (1):75-86.