ISOLATION OF KLEBSIELLA SPP. FROM SOME MEATS

INTRODUCTION

المقدمــة

تعد اللحوم من أکثر أنواع الأغذية عرضة للفساد بسبب سهولة نمو الأحياء الدقيقة فيها، وخاصة الجراثيم التي يمکن أن تغزو اللحوم من مصادر مختلفة، فقد تکون من مصدر حيواني داخلي؛ فهي توجد ضمن الجهاز الهضمي للحيوان خاصة (القولون)، وعلى الجلد وغيرها، أو تکون من مصدر خارجي عن طريق مهاجمتها للذبيحة بعد ذبح الحيوان. وما ان تصل هذه الأحياء إلى اللحم حتى تجد الوسط الملائم للنمو والتکاثر، نظراً لأنه يحتوي على العديد من العناصر الغذائية الضرورية لنموها. لذلک من المهم التحري عن وجود أنواع من الجراثيم الممرضة في اللحوم، مثل: الايشريشيا القولونية  E. coli والشيغيلةShigella  والسالمونيلة Salmonella والکلِبْسيلَّة Klebsiella التي هي هدف دراستنا.

سميت الکلِبْسيلَّة Klebsiella من قبل عالم الأحياء المجهري الألماني إدوين کليبس (1834-1913)، وهي جراثيم عصوية، تتراوح أبعادها من (µm0.1-3(0.6-6.0 µm) x (0.، سالبة الغرام، محاطة بمحفظة، تترتب بشکل مفرد، أو أزواج، أو سلاسل قصيرة، تتوافق مع التعريف العام لفصيلة الإمعائيات Enterobacteriaceae، ماعدا الکلِبْسيلَّة وبيليس K. mobilis ، لا هوائية اختيارية (Garrity, 2005)، غير متحرکة، تخمر اللاکتوز، موجبـة اليوريـاز، غير منتجـة لغـاز کبريت الهيدروجين H₂S، مستعمراتها مخاطية، وأحيانا تکون لزجة ملتصقة بسطح الآجار (Guetta et al., 2003). تُفرز الکلِبْسيلَّة ذيفاناً داخلياً متحملاً للحرارة نسبياً، ونذکر من أهم الأعراض السريرية التي يحرضها الذيفان الداخلي: الحمى، وتحرير وسائط الالتهاب، واستنزاف بروتينات المتممة، إضافةً إلى فرط ضغط الدم (Dokladny et al., 2010)، کما أنها تفرز أنزيم يورياز (Urease) الذي يلعب دوراً هاماً في آفة الجهاز البولي، حيث يقوم بحلمهة البولة إلى أمونيا وغاز ثاني أوکسيد الکربون (CO₂)، مما يؤدي إلى تحول فوسفات المغنزيوم إلى مرکب مشبع وتحـول فوسفـات الکالسيوم إلى الشکل البلوري مما يُسَبِّب حدوث خلل وظيفي في الکلية وهو أحد مظاهر الالتهابات في الجهاز البولي؛ وبهذا تعتمد إمراضية الکلِبْسيلَّة على النمط الجرثومي وعوامل الفوعة (Augustin et al., 2009). إن الغالبية العظمى من الإصابات بهذه الجراثيم ترتبط بعدوى المستشفيات وتشير الدراسات العلمية أن الکلِبْسيلَّة تسبب حوالي 8% من حالات العدوى الجرثومية في المستشفيات، في الولايات المتحدة الأمريکية وأوروبا (Brooks et al., 2004)، حيث تُصيب وبالدرجة الأولى المرضى في المستشفيات الذين يعانون من نقص في المناعة، الأطفال، مرضى السکري، المدمنين على الکحول، والذين يعانون من انسداد رئوي مزمن (Anderson et al., 2006)، وقد وضعت الکلِبْسيلَّة بين ثمانية من أهم مسببات العدوى بالمستشفيات إذ تأتي بالمرتبة الثانية بعد الإيشيريشيا القولونيةE. coli (Anonymous, 2002). هناک 7 أنواع مختلفة من جراثيم الکلِبْسيلَّة التي تبدي تشابهاً في الـحمض النووي DNA (Garrity, 2005). ومن أکثر هذه الأنواع أهميةً من الناحية الطبية هي الکلِبْسيلَّة الرئوية K. pneumoniae، حيث تُعد من أهم الممرضات سريرياً من بين الإمعائيات، وبدايةً عُرِفَت بأنها تُصيب جهاز التنفس، مسببة الالتهاب الرئوي بشکل أساسي، ويمکن أن تؤدي إلى التهاب واسع النطاق، ومن ثم النزف فالموت (Rosen et al., 2008). تليها الکلِبْسيلَّة المُعجِلة للولادة K. oxytoca التي تُشبـه الرئوية بکونها تُحْدِث آفة في الجهـاز التنفسـي، وتسبب التهـاب الغشـاء المخاطي الأنفي، والدم والتهاب الأذن الوسطى القيحي الحاد (Bleich et al., 2008). يتميز النوع  المُعجل للولادة عن باقي الأنواع بکونه ايجابي الأندول کما أن لها خصائص نمـو مختلفـة قليلاً حيث أنهـا يمکـن أن تنمـو على وسـط يحـوي Melezitose ولا تنمو على وســط يحــوي 3-hydroxybutyrate بينما ينمو عليه النوع الرئوي Högenauer et al., 2006)). تعد جراثيم الکلِبْسيلَّة (الرئوية والمُعجِلة للولادة) من العوامل الممرضة الانتهازية التي تسبب للإنسان أمراضاً خطيرة قد تؤدي إلى الوفاة. فقد تسبب التهابات رئوية حادة لمرض ذات الرئة، إنتانات بولية وتناسلية وهضمية، التهاب القولون، تجرثم الدم Bactermia، وفي حالات نادرة تسبب التهاب السحايا (Rodrigues, 2008).

MATERIALS and METHODS

مواد البحث وطرائقه

1- المواد:

أوساط الاستنبات والزرع:

ماء الببتون الموقي Buffered Pepton Water (BPW)، وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار Eosin Methylen blue Agar (EMB) Agar، وسط ماکونکي آجار MacConkey Agar، وسط سيمون سترات Simon citrat، وسط لوريا بيرتان Luria Bertani Agar (LB)، وسط مانيتول سولت آجار Manitol Salt Agar (MSA)، ومنمي عام مع الصاد الحيوي الفانکومايسين LB+Van 25 mg/ml)).

مواد الاختبارات الحيوية الکيميائية:

ماء أوکسجيني (3%)، ستريبات أوکسيداز (BD,USA) BBL^TMDrySlide^TM، KOH، ألفا نفتول، أحمر الميتيل، وسط MR-VP، کاشف الأندول Indole test reagent (Ehrlich  Kovacs). وسط Ttriple Sugar Iron Agar، وسط(SIM) Sulfur reduction-Indole production- Motility ، وسط MacConkey Agar، وسط Simon citrat، أملاح التترازوليوم Tetrazolium Salts.

مواد عزل الجينوم الجرثومي:

الوقاء TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0)، SDS 10%، بروتيناز K 20mg/ml، NaCl 5M، CTAB NaCl، کلوروفورم إيزوأميل الکحول (24:1)، فينول کلوروفورم إيزوأميل الکحول (25:24:1)، إيزوبروبانول، إيتانول 70%.

مواد التفاعل السلسلي للبوليميراز والرحلان:

وقاء PCR 10X(200mM Tris-HCl  pH8.8, 100mM KCl,100mM (NH₄)₂SO₄, 1mg/ml BSA,  1% Triton)، MgSO₄، نکليوتيدات (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)، أنزيم DNA بوليميراز، مرئسات نوعية الجدول [1]، هلامة الآجاروز 1.5% (W/V)، الوقاء 1X TAE المحضر من الوقاء 50X TAE (0.4M Tris-Base, 10mM EDTA pH 8.0, 57.1 ml Glacial Acetic Acid ).

مادة الحفظ: غليسيرول 50%.

2- الطرائق:

2- 1 جمع العينات Sample collection:

بلغ عدد العينات 100 عينة، من اللحوم (عجل، ضأن، دجاج). وقد جُمِعَت من مناطق مختلفة من دمشق وريفها.

2-3 معالجة العيناتSample processing :

بعد بعد سحق 0.5 غ من العينة المدروسة:

تم الاستنبات الأولي غير الاصطفائي في وسط ماء البيبتون الموقي Buffered Peptone Water (BPW) في الدرجة 37°م لمدة 24 ساعة.

• تم الاستنبات الاصطفائي على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار EMB 37°م لمدة 24 ساعة.
• تم انتقاء المستعمرات المخاطية ذات الهالة الوردية، ذات المحفظة لإجراء:
• التفاعل السلسلي للبوليميراز (PCR) باستخدام مرئسات نوعية.
• اختبارات حيوية کيميائية (الأوکسيداز، الکاتالاز، اليورياز، غاز کبريت الهيدروجين H₂S، الأندول، تخمر السکاکر).

2-4 مراحل العمل:

• ·        التعداد العام الکلي :

قبل التحري عن وجود الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم، نقوم بإجراء التعداد الکلي للإمعائيات وللکلِبْسيلَّة على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار EMB، وإجراء التعداد العام الکلي للجراثيم على وسط منمي عام هو لوريا بيرتان آجار Luria Bertani Agar (LB)  ومنمي عام مع الصاد الحيوي الفانکومايسين LB+Van 25 mg/ml)) لتنمية سلبيات الغرام دون ايجابيات الغرام، ووسط مانيتول سولت آجار  (MSA) Manitol Salt Agar لتنمية ايجابيات الغرام.

• عزل الکلِبْسيلَّة من عينات اللحوم:

يتضمن زرع جراثيم  الکلِبْسيلَّةKlebsiella spp. عدة مراحل:

1- مرحلة الاستنبات الأولي: تم سحق 0.5 غ من العينة وتنميتها في 4.5 مل من ماء الببتون الموقي (BPW) بالدرجة 37°م لمدة 24 ساعة.

2- مرحلة الاستنبات الاصطفائي: حيث يؤخذ 10 μl من الوسط السابق ويتم زرعها على وسط ايوسين ميثيلين بلو أجار (EMB)، ثم تحضن بالدرجة 37°م لمدة 24 ساعة. وللحصول على هذه الجراثيم نقيةً تؤخذ مستعمرة مفردة وتزرع على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار (EMB) وتکرر هذه العملية حتى نحصل على طبق يحوي مستعمرات نموذجية فقط.

3-  توصيف المستعمراتColony characteristics:

   تبدو مستعمرات الکلِبْسيلَّة النموذجية على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار (EMB): کبيرة قطرها بين (3- 4 مم)، محدبة الشکل، مخاطية، غامقة بنفسجية ذات هالة وردية. تُنتقى هذه المستعمرات من أجل تلوينها.

4-  الفحص المجهري:

• ·         صبغة غرام Gram Staining:

يُحضر الغشاء الجرثومي ثم يُلون بواسطة طريقة غرام، کالتالي:

1. يُغمر المحضر بمحلول البلورات البنفسجية لمدة 30 ثانية.
2. يُغسل المحضر بالماء لإزالة الفائض من الملون.
3. يُغمر المحضر بمحلول لوغول لمدة 30 ثانية.
4. يُغسل المحضر بالماء لإزالة الفائض من المحلول.
5. يُغمر المحضر بمزيل اللون (کحول + أسيتون) لمدة 15 ثانية.
6. يُغسل المحضر جيداً بالماء حتى لا يبقى أثر لمزيل اللون.
7. يُغمر المحضر بمحلول الفوکسين الممدد لمدة 30 ثانية.
8. يُغسل المحضر بالماء ويُجفف، ويُفحص تحت المجهر باستخدام العدسة الغاطسة.

• ·      تلوين المحفظة Capsular staining:

1. يُحضر الغشاء الجرثومي ويثبت بالطريقة المعتادة (استخدام الکحول مع تجنب استخدام الماء) -لأن المحفظة تذوب بالماء.

     يُغمر الغشاء بمحلول 30% من صبغة الفوکسين القاعدية، وتُمرر الصفيحة فوق اللهب حتى يبدأ الملون بالتبخر.

1. يُغسل الغشاء بمحلول کبريتات النحاس 20%.
2. يُغمر الغشاء في محلول أزرق المتيلين 1%، ثم يُغسل بالماء.
3. تُجفف الصفيحة وتُفحص تحت المجهر باستخدام العدسة الغاطسة.

2-5- التفاعل السلسلي للبوليميراز PCR:

أُجرِي التفاعل السلسلي للبوليمراز (PCR) على المستعمرات النموذجية النامية على وسط ايوسين ميثيلين بلو آجار (EMB) بعد عزل الجينوم الجرثومي لها وفق مايلي:

1. نُمِّيَت الجراثيم في ماء الببتون الموقي ثم ثُفِلَت لمدة 5 دقائق بسرعة 4000 rpm وفي الدرجة +4 مْ وتمَّ التخلص من السائل الطافي.
2. حُلَّ الراسب في 567 μl من الموقي TE  بوساطة الممص الصفري، ثم أُضيف له 30 μl من الـ 10% SDS و 3 μl من الـ 20 mg/ml proteinase K. مُزِج المجموع وحُضِن لمدة ساعة بالدرجة 37°م مع الرج بسرعة 1000 rpm.
3. أُضيف 100 μl من الـ 5M NaCl ومُزِج جيداً ثم أُضيف 80 μl من محلول الـ CTAB/NaCl. مُزِج المجموع وحُضِن لمدة 10 دقائق بالدرجة 65°م مع الرج بسرعة 1000 rpm.
4. أُضيف 780 μl من الـ chloroform/isoamyl alcohol (24:1) ومُزِج ثم ثُفِّل لمدة 5 دقائق بسرعة 14500 rpm ونُقِل الطافي إلى أنبوب جديد مع تجنب سحب أي جزء من الطبقة الوسطى البروتينية.
5. أُضيف للطافي حجم مماثل من الـ phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) ومُزِج ثم ثُفِّل لمدة 5 دقائق بسرعة 14500 rpm ونُقِل الطافي بعدها إلى أنبوب جديد مع تجنب سحب أي جزء من الطبقة الوسطى البروتينية.
6. أُضيف إلى الطافي النهائي کمية من الإيزوبروبانول تعادل 0.6 مل من حجمه ومُزِج بلطف بقلب الأنبوب 4-6 مرات حتى يترسب الدنا DNA حيث يظهر بشکل خيوط سابحة في السائل ثم ثُفِّل لمدة 5 دقائق بسرعة 14500 rpm ثم تمَّ التخلص من الإيزوبروبانول بلطف لتجنب رمي الدنا DNA.
7. غُسِل الراسب بإضافة 1 مل من الإيتانول %70  ثم ثُفِّل لمدة 5 دقائق بسرعة 14500 rpm وتمَّ رمي الطافي وجُفِّف الراسب بوساطة جهاز الـ Concentrator (شرکة  Eppendorf).
8. تمَّ حل الراسب الناتج في 25 μl من الموقيTE  ثم قِيس ترکيزه بوساطة جهاز المطيافية (Nano Drop) ومُدِّد للوصول إلى ترکيز يساوي 100 ng/μl.

    أُجري التفاعل السلسلي للبوليميراز PCR على الدنا DNA المعزول من باستخدام البادئات النوعية الموضحة في الجدول رقم [1].

الجدول رقم 1: البادئات النوعية المستخدمة لجنس الکلِبْسيلَّة.

أُجري التفاعل بحجم 25 µl ويوضح رقم [2] المواد المستخدمة في التفاعل، في حين يوضِّح الجدول رقم [3] الشروط اللازمة لحدوث هذا التفاعل.

الجدول رقم 2: المواد المستخدمة في تفاعل الـ PCR

الجدول رقم 3: شروط تفاعل الـ PCR

ومن ثم تمَّ الکشف عن نواتج الـ PCR باستخدام هلامة الآجاروز 1.5% (W/V) المحضرة في الوقاء 1X TAE  والترحيل على فولطية 85 V لمدة نصف ساعة.

تمَّ الاحتفاظ بالمستعمرات المؤکدة في الـ BPW مع الغليسيرول 50%، ومن ثم حُفِظت بالدرجة 80-°م من أجل الدراسات اللاحقة.

2-6 الخصائص الحيوية الکيميائية Biochemical Identification:

أُجرِيَت على العزلات المؤکدة عن طريق التفاعل الـسلسلي للبوليمرازPCR) ) بأنها کلِبْسيلَّة، الاختبارات الحيوية الکيميائية التالية:

• اختبار الحرکة: أُجري باستعمال الآجار نصف الصلب (وهو ماء الببتون الموقي المضاف إليه کمية من الآجار) والمضاف إليه أملاح التترازوليوم  Tetrazolium Salts(وهو ملون حيوي يحافظ على الخلايا الجرثومية ويصبغ الجراثيم باللون الأحمر ولا يصبغ الوسط)، حيث يتم التلقيح بطريقة الوخز، فإذا کان الجرثوم متحرک يُلاحظ تفشي اللون الأحمر بالوسط حسب حرکة الجرثوم، أما إذا کان الجرثوم غير متحرک فيلاحظ اللون الأحمر مکان الوخز فقط.
• اختبار الأوکسيداز: أُجرِي باستعمال ستريبات (BD,USA) BBL^TMDrySlide^TM حيث يُوضع عليها جزء من المستعمرة فإذا تغير اللون إلى الأزرق البنفسجي يُعتبر التفاعل إيجابياً، في حين يُعتبر سلبياً إذا لم يتغير اللون.
• اختبار الکاتالاز: أُجرِيَ باستعمال الماء الأکسجيني (3%)، حيث يُوضع هذا الأخير على شرائح زجاجية ثمَّ يوضع فوقها جزء من المستعمرة، يُعتبر التفاعل إيجابياً في حال ظهور فقاعات، ويکون سلبياً في حال عدم ظهورها.
• اختبار تخمير اللاکتوز:أُجرِيَ باستعمال أطباق تحتوي على وسط ماکونکي آجار MacConkey Agar الحاوي على سکر اللاکتوز، إذ تقوم الجراثيم المخمرة للاکتوز بإنتاج مرکبات حمضية تخفض درجة ترکيز الأيون الأيدروجيني (pH) إلى أقل من 6.8 مما يتسبب بتغير لون الوسط لاحتوائه على مشعر لوني هو الأحمر المعتدلneutral red .
• اختبار استقلاب السترات: أُجري باستعمال أنابيب تحوي على وسط سيمون سترات الذي يحوي على سيترات الصوديوم، إذ أن الجراثيم التي يمکن أن تفکک السترات هي وحدها تستطيع النمو على هذه الوسط، وتنتج مرکبات قلوية ترفع قيمة درجة ترکيز الأيون الأيدروجيني (pH) مما يتسبب بتغير لون الوسط لاحتوائه على مشعر لوني هو أزرق بروموتيمول.
• اختبار حلمهة البولةUrease : أُجري باستعمال أنابيب تحوي على وسط اليوريا Urea، إذ تقوم الجراثيم التي تصطنع أنزيم اليورياز بتفکيک البولة إلى نشادر والذي يتحول بدوره إلى فحمات الأمونيوم التي تقلون الوسط مما يتسبب بتغير لون الوسط لاحتوائه على مشعر لوني هو حمرة الفينول.
• اختبار تخمر السکاکر(اللاکتوز والغلوکوز والسکروز): أُجري باستعمال أنابيب تحوي على وسط ثلاثي سکر الحديد Triple Suger Iron Agar  (عادة يوزع في الأنابيب بحيث يکون قسم قائم وقسم مائل)، و يکون لون الوسط أحمر لأنه يحتوي على مشعر لوني هو حمرة الفينول، يلقح بطريقة الوخز للقسم القائم وبطريقة التخطيط للقسم المائل، وبعد الزرع نستطيع تمييز الحالات الموضحة في الجدول رقم [4].

الجدول رقم 4: حالات نمو الجراثيم على وسط ثلاثي سکر الحديد

• §      اختبار إنتاج غاز کبريت الهدروجين H₂S: أُجري باستعمال أنابيب تحوي على وسطSIM، ثم حُضِنَ المُسْتَنْبَت في درجة حرارة 37°م لمدة 24 ساعة، في حال تشکل لون أسود ضمن الوسط فهذا يدل على أن الجراثيم قد أنتجت غاز کبريت الهدروجينH₂S.
• اختبار إنتاج الأندول Indole Production Test: أُجري باستعمال أنابيب تحوي على وسط SIM ، ثم حُضِنَ المُسْتَنْبَت في درجة حرارة 37°م لمدة 24 ساعة.استخدم هذا الاختبار للکشف على قابلية بعض أنواع من الجراثيم على تحليل الحامض الأميني وإنتاج الأندول. ويتم الکشف عن الأندول بإضافة قطرات من کاشف الکوفاکسkovax reagent  للوسط الزرعي المحضّن 24 ساعة، إنَّ تشکل حلقة حمراء في قمة الأنبوب هو مؤشر لنتيجة ايجابية بينما عدم تغير اللون و تشکل حلقة صفراء مؤشر لنتيجة سلبية.
• اختبار أحمر الميتيل والفوکس بروسکاوير: أُجرِيَ تنمية الجراثيم في (3) مل من وسط  MR-VP وهو وسط يضم بيبتون ووقاء وغلوکوز أو ديکستروز، ثم حُضِنَ المُسْتَنْبَت في درجة حرارة 37°م لمدة 24 ساعة، ثم تُقسم العينة إلى قسمين ليتم إجراء اختبار أحمر الميتيل على أحدهما واختبار الفوکس بروسکاوير على الآخر.

¨   اختبار أحمر الميتيل: أُجرِيَ بإضافة بضع قطرات من مشعر أحمر الميتيل إلى المُسْتَنْبَت، إذ يدل تغير اللون إلى الأحمر على إيجابية التفاعل (pH الوسط أصغر من 4)، حيث تقوم بعض أنواع الجراثيم بتحويل الغلوکوز أو الديکستروز إلى مرکبات حمضية ثابتة مثل حمض اللبن أو حمض الخل أو حمض النمل وبذلک تتغلب هذه المرکبات الحمضية على الموقي، ويصبح الوسط حمضياً، أما تَغَيُّر اللون إلى البرتقالي (pH الوسط يساوي 7) وإلى اللون الأصفر ( pH الوسط أکبر من 7) فيدلان على أن التفاعل سلبي.

¨   اختبار الفوکس بروسکاوير: أُجرِيَ بإضافة 0.5 مل إلى المستنبت من الکاشف A- هيدروکسيد البوتاسيوم- (KOH) و0.5 مل من الکاشف B- ألفا النفتول- (α-naftol)، إذ يدل تغير اللون إلى الأحمر على إيجابية التفاعل، حيث يکشف هذا الاختبار عن الأحياء المنتجة للأسيتوئين (أسيتيل ميثيل کاربينول) الذي يتأکسد بوجود هيدروکسيد البوتاسيوم إلى دي أسيتيل، والذي يتفاعل بدوره منتجاً اللون الأحمر، أما ظهور اللون النحاسي فيدل على سلبية التفاعل.

RESULTS and SISCUSSION

النتائج والمناقشـة

يُوضح الجدول رقم [5] أن التعداد العام للجراثيم أکبر من 10⁹ خلية/مل، وأن التعداد العام للجراثيم سالبة الغرام يتراوح بين 5.4 x 10³ إلى 2.7 x 10⁶ خلية/مل؛ بينما کان تعداد الجراثيم موجبة الغرام يتراوح بين 5x10² إلى 7.5x10³  خلية/ملللعينات المدروسة. کان تعداد الإمعائيات بين5x10²حتى 7.5x10³ منها کان تعداد جراثيم الکلِبْسيلَّة من  2.5x 10²إلى  .1.9x10⁴

الجدول رقم 5: التعداد العام الکلي للجراثيم على أوساط مختلفة

شکلت الکلِبْسيلَّة النامية على الوسط الانتقائي ايوسين ميثيلين بلو آجار EMB مستعمرات کبيرة محدبة مخاطية، ثخانتها حوالي (3.0 µm) وطولها حوالي (1.0 µm)، بلون بنفسجي غامق ذات هالة وردية، بدت الکلِبْسيلَّة تحت المجهر الضوئي بشکل عصيات قصيرة rod-shaped، سالبة لصبغة الغرام، محاطة بمحفظة.

على أساس شکل المستعمرات على الوسط الإنتقائي تم انتقاء 46 عزلة من أصل 100 عينة، يُوضح الجدول رقم [6] نتائج التحري عن Klebsiella في 001 عينة لحم حيث وُجِدت في 46 عينة موزعة على النحو التالي: 23 عينة لحم عجل و14 عينة لحم ضأن و9 عينة لحم دجاج.

الجدول رقم 6: النسبة المئوية لعزلات الکلِبْسيلَّة من عينات اللحوم المدروسة

ثم إجراء التفاعل السلسلي للبوليمراز، حيث يُوضح الشکل رقم [1] تفاعل الـ PCR على المستعمرات النموذجية لتمييز الکلِبْسيلَّة في عينة اللحوم الملوث، وذلک باستعمال البادئات النوعية لجنس الکلِبْسيلَّة (الجدول رقم 1).

الشکل [1] کشف DNA الکلِبْسيلَّة بواسطة الـ PCR

يُلاحظ في المسار 1 هو ناتج PCR لعينة خالية من DNA (شاهد سلبي للتقنية). إن المسارات (2-3-4) هي عصابات دنا الجراثيم المعزولة من عينات اللحوم على أوساط انتقائية، والتي تکافئ في الحجم الجزيئي 1500 أساس آزوتي لعصابة الکلِبْسيلَّة العيارية (حصلنا عليها من مخابر هيئة الطاقة الذرية السورية) الموجودة في المسار 6؛ بينما کان المسار5 نتيجة التقانة الايجابية لعينة Enterobacter sakazakii مع مرئساتها النوعية، مما يؤکد العزل النوعي لجنس الکلِبْسيلَّة من هذه العينات. يُلاحظ من الشکل أنه يمکن استخدام تقنية PCR لتمييز الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم الملوثة. لتحديد الکلِبْسيلَّة المعزولة من عينات اللحوم، تم إجراء الاختبارات الحيوية الکيميائية على کل الجراثيم التي تم نموها على الوسط الانتقائي. حيث بدت معظم الکلِبْسيلَّة المعزولة، غير متحرکة، سالبة الأکسيداز، إيجابية للکاتالاز، مخمرةَ لسکر اللاکتوز، مخمرة لسکريّ الغلوکوز والسکروز، بعض هذه العزلات نمت على وسط سيمون سترات وقلون الوسط، وغير منتجة لغاز کبريت الهيدروجين H₂S. أنتجت بعض سلالات الکلِبْسيلَّة المعزولة أنزيم اليورياز، وأثبتت بعض أنواع هذه الجراثيم القابلية على تحليل الحامض الأميني وإنتاج الأندول بعد الحضن بدرجة 37مْ، وکانت من النوع K. oxytoca وهذا يتوافق مع نتائج الدراسات العالمية حول هذه الجراثيم (Garrity, 2005). إن نتائج الاختبارات الحيوية الکيميائية تشير إلى أن الکلِبْسيلَّة المعزولة هي من نوعين مختلفين أو أکثر. تم الحصول على السلالات العيارية المستخدمة في هذه الدراسة من مخبر الميکروبيولوجيا والمناعيات في هيئة الطاقة الذرية السورية، (Kp = K. pneumoniae - *Ko = K. oxytoca*). يُوضح الجدول رقم [7] نتيجة هذه الاختبارات لبعض المستعمرات المعزولة من اللحوم.

الجدول رقم 7: نتائج الاختبارات الحيوية الکيميائية للکلِبْسيلَّة

إنَّ الکلِبْسيلَّة واسعة الانتشار، وهي تمتلک اثنين من البيئات، الأول: تکون في البيئة حيث توجد في المياه السطحية، مياه الصرف الصحي، التربة، وعلى النباتات؛ والثاني: حيث تکون مستعمرة للسطوح المخاطية عند الثدييات (الإنسان، الأبقار، والأغنام...الخ) (Curtis et al., 2008). احتلت منذ سنوات المقام الأول بين أمراض المستشفيات الخمجية الانتهازية، فهي تستطيع أن تسبب خمجاً تالياً في کل آفة (Maltezou et al., 2009). هناک اهتمام کبير عند حدوث الأمراض بسبب جراثيم الکلِبْسيلَّة، حيث تمتلک هذه الجراثيم آليات للدفاع کونها تمتلک مستضدات محفظية K)) المرمزة للمحفظة التي تقاوم عملية البلعمة، وتقاوم درجة الحرارة 100 مْ. کما أنها تملک نظام أنزيمي (مثل الکاتالاز) يُعدّ من آليات الدفاع ضد البالعات الکبيرة، حيث أن البالعات تمتلک المقدرة على إرجاع الأکسجين إلى ماء أکسجيني أو أکسجين فعّال، وتعدّ هاتين الجزيئتين سامتين للجراثيم ولذلک فإن الکاتالاز يحفّز عودتهما إلى أکسجين عادي وماء (Nordmann et al., 2009)، ولذلک تُعدّ الکلِبْسيلَّة موجبة الکاتالاز. لقد أظهرت نتائجنا أنه يمکن التحري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم بواسطة التفاعلات الحيوية الکيميائبة وبواسطة التضخيم السلسلي مستخدمين مرئسات نوعية للمورثة 16sRNA المحافظة ضمن الجنس.

إن تقنية الـPCR  لا تستغرق سوى يوم واحد، وهذا يفيد في إمکانية استخدامها کطريقة عيارية في الکشف عن الکلِبْسيلَّة. کما أنها تقنية تجنب العاملين في مخابر الجراثيم من الإصابة بهذه الجراثيم، وهي أسرع وأکثر حساسية من الاختبارات الحيوية الکيميائية ونعتقد أنها ستکون المعتمدة في المستقبـل للتحـري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم (Min Wang et al., 2008). أظهرت الخصائص الشکلية والحيوية کيميائية أن نسبة الکلِبْسيلَّة في اللحوم بمختلف أنواعها 46% وهذا ما يتوافق إلى حد ما معStiles  و Lai-King حيث کانت نسبة تواجد الکلِبْسيلَّة ضمن دراستهما 46% (Stiles and Lai-King, 1981). بينما لم تتوافق نتائجنا مع Messaoudi وزملاؤه حيث کانت نسبة الکلِبْسيلَّة في اللحوم  33.3% (Messaoudi et al., 2009). ونعتقد أن سبب الاختلاف في نسبة الفلورا من الکلِبْسيلَّة في البيئة المحيطة بالحيوانات في ألمانيا عنه في سورية. لاحظنا أن عدد الدراسات التي تبحث عن الکلِبْسيلَّة في اللحوم الخام قليل نسبياً وذلک قد يکون بسبب عدم تواجدها ضمن الفلورا الطبيعية للحوم، أو أنه تقليدياً يتم التحري عن الکلِبْسيلَّة ضمن الوجبات السريعة والعينات الطبية لأنها تعتبر من الجراثيم التي تنتقل عبر عدوى المستشفيات. لکن رغم ذلک أظهرت نتائجنا نسبة لا بأس بها من الکلِبْسيلَّة ضمن عينات اللحوم الخام مما يدل على جدوى الدراسة من تطوير اختبار تفريقي للکلِبْسيلَّة ضمن اللحوم؛ کما أنه يجب متابعة البحث لتحديد الفوعة المرضية لهذه العزلات لمعرفة فيما إذا کانت تُساهم في إصابة الجهاز البولي-التناسلي أو الجهاز التنفسي أو حتى تجرثم الدم. وللأسباب السابقة الذکر کان الهدف من دراستنا في التحري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم لکي تکون الخطوة الأولى في دراسة وبائية هذه الجراثيم في محافظتي دمشق وريفها. وحالياً نحن في صدد متابعة أبحاثنا حول اختبار حساسية ومقاومة عزلات الکلِبْسيلَّة المعزولة في مخابرنا لبعض الصادات الحيوية المستخدمة في علاج مرضى الالتهابات الرئوية وتحديد فعاليتها في هذه المعالجة.

الاستنتاجات

لقد أظهرت نتائجنا أنه يمکن التحري عن الکلِبْسيلَّة في عينات اللحوم بواسطة التفاعلات الحيوية الکيميائية وبواسطة التضخيم السلسلي مستخدمين مرئسات نوعية للمورثة 16sRNA المحافظة ضمن الجنس.

REFERENCE

Anderson, D.J.; Engemann, J.J.; Harrell, Carmeli, L.J.Y.; Reller, L.B. and Kaye, K.S. (2006): Predictors of mortality in patients with bloodstream infection due to ceftazidime-resistant Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother., V. 50, pp.        1715–1720.

Anonymous, (2002): The cost of antibiotic resistance: effect of resistance among Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa on length of hospital stay. Infect. Control Hosp. Epidemiol, V. 23, pp. 106–108.

Augustin, A.; Seng Duong, L.; Kalavsky, E.; Liskova, A.; Kisac, P. and Krcmery, V. (2009): Colonization with cefotazime-resistant Enterobacter spp. and Klebsiella spp. in HIV-positive Cambodian children decreases with immune reconstitution after HAART. J. Chemother., V. 21, pp. 232-233.

Bleich, A.; Kirsch, P.; Sahly, H.; Fahey, J.; Smoczek, A.; Hedrich, H.J. and Sundberg, J.P. (2008): Klebsiella oxytoca: opportunistic infections in laboratory rodents.Lab Anim., V.42, pp. 369-375.

Brooks, S.E.; Walczak, M.A.; Malcolm, S. and Hameed, R. (2004): Intrinsic Klebsiella pneumoniae contamination of liquid germicidal hand soap containing chlorhexidine. Infect. Control Hosp Epidemiol., V. 25, pp. 883–885.

Curtis, L.; Nakipoglu, Y.; Kucuker, M.A.; Katranci, H. and Derbentli, S. (2008): Need for more environmental control of Klebsiella and other gram negative infections. Saudi Med J., V.29, pp. 1069.

Dokladny, K.; Lobb, R.; Wharton, W.; Thomas, Y. and Moseley, P. (2010): LPS-induced cytokine levels are repressed by elevated expression of HSP70 in rats: possible role of NF-_ΚB, Cell Stress Chaperones, V.15, pp. 153–163.

Garrity, M. (2005): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Department of Microbiology and Molecular Genetics, V.2, pp. 716-724.

Guetta, O.; Milas, M. and Rinaudo, M. (2003): Structure and properties of a bacterial polysaccharide from a Klebsiella strain (ATCC 12657). Bio. Macro.  Molecules., V. 4, pp. 1372-1379. Handling. Applied and Environmental Microbiology, V.41, pp.      867-872.

Högenauer, C.; Langner, C. and Beubler, E. (2006): Klebsiella oxytoca as a causative organism of antibiotic-associated hemorrhagic colitis. The New England Journal of Medicine. V. 355, pp 2418-2426.

Maltezou, H.C.; Giakkoupi, P.; Maragos, A.; Bolikas, M.; Raftopoulos, V.; Papahatzaki, H.; Vrouhos, G.; Liakou, V. and Vatopoulos, A.C. (2009): Outbreak of infections due to KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae in a hospital in Crete. Journal of Infection, V. 58, pp. 213-219.

Messaoudi, A.; Gtari, M.; Boudabous, A. and Wagenlehner, F. (2009): Identification and susceptibility of Klebsiella and Enterobacter spp. isolated from meat products. African Journal of Microbiology Research, V.3, pp. 362-369.

Min Wang; Boyang Cao; Qunfang, Yu.; Lei Liu; Qili Gao; Lei Wang and Lu FengJ Clin.  (2008): Microbiol Analysis of the 16S–23S rRNA Gene Internal Transcribed Spacer Region in Klebsiella Species. J.clin. Microbiol., V. 46, pp 3555–3563.

Nordmann, P.; Cuzon, G. and Naas, T. (2009): The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet. Infect. Dis., V.9, pp. 228–236.

Rodrigues, P.; Almeida, AM.; Bertoni, BW. And Rclr, P. (2008): Assessment of Genntic relationship between Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca samples isolated from a dental office. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop., V.14, pp. 703-718.

Rosen, D.A.; Pinkner, J.S.; Jones, J.M.; Walker, J.N.; Clegg, S. and Hultgren, S.J. (2008): Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect. Immun., V.76, pp. 3337-3345. Stiles, M. Lai-King, NG., 1981. Enterobacteriaceae Associated with Meats and Meat.