EXPERMENTAL INFECTION STUDY OF NEOSPORA CANINUM STRAINS IN MICE

Dept. of Microbiology,

Faculty of Veterinary Medicine,

Al-Baath University, Syria Arab Republic.

EXPERMENTAL INFECTION STUDY OF NEOSPORA CANINUM STRAINS IN MICE

(With 5 Tables and 8 Photos)

By

W.A. AL-OBAIDII;M.M. Katranji and A. AL-Khaled

(Received at 15/12/2011)

دراسة الخمج التجريبي بذراري البوغة الجديدة الکلبية في الفئران

وسن أمجد العبيدي , محمد محسن قطرنجي , عبد الکريم الخالد

تم إجراء إصابة تجريبية بفئران مخبرية (سويسرية بيضاء) بالحيوانات التسرعية لذراري البوغة الجديدة الکلبية (NC-5,Nc1,BPA4) ، والمنماة مسبقا على خلايا الزرع الخلوي من نوع خلايا کلية أجنة القرود الأفريقية الخضراء وذلک لغرض معرفة مدى أمراضية هذه الذراري ولدراسة الأعراض المرضية والتغيرات النسجية التي تحدثها , حيث تم حقن الطفيلي في التجويف الصفاقي ومن ثم تم مراقبة الحيوانات لمدة 90 يوما بعد الحقن،وتم جمع عينات (الدم، الدماغ ، العضلات الهيکلية، القلب) من الفئران بفترات متباينة لتشخيص وجود الطفيلي باستخدام المزارع الخلوية وتفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي والمقاطع النسجية ، مع ملاحظة الأعراض السريرية الظاهرة على الحيوانات المصابة تجريبيا. تبين من خلال النتائج ظهور أعراض مرضية متمثلة (خشونة في الشعر ، تحدب الجسم ، فقدان الوزن ،علامات عصبية مثل ميلان الرأس وضعف في الحرکة)، حيث کانت هذه الأعراض متباينة حسب نوع الذرية ، حيث ظهرت بفترات مبکرة للذريتين NC-5، BPA4مقارنة بالذرية Nc1 ، وقد بينت نتائج تنمية الطفيلي من الأعضاء التي تم جمعها من الفئران المحقونة بالذراري تباينا في التغيرات المرضية الخلوية على خلايا الزرع الخلوي  ،حيث ظهرت التغيرات في التمريرة الثالثة لکل من NC-5 ,BPA4 مقارنة بالذرية Nc1 التي ظهرت فيها التغيرات في التمريرة الرابعة وبمعايير مرتفعة للذرية BPA4 مقارنة بالذريتين الاخريتين ،کما تبين ظهور الطفيلي في خلايا الزرع الخلوي في عينات الدم بعد 14 يوما من الإصابة للذرية NC-5 مقارنة بباقي الذراري والأعضاء ، وبينت نتائج تفاعل سلسلة البوليمريز وجود نتائج ايجابية في المزارع الخلوية وبصورة مبکرة للذرريتين NC-5، BPA4 مقارنة بالذرية Nc1 . فيما أظهرت المقاطع النسجية وجود الأکياس النسجية مع استکفاف وعائي ووجود بؤر لتجمعات الخلايا الدبقية , فقدان اللبد العصبي مع ارتشاح خلايا أحادية النواة في الدماغ ، أما في العضلات الهيکلية فتبين وجود الخلايا اللمفاوية والبلازمية وبعض الخلايا البلعمية , بينما اظهرت المقاطع النسجية للقلب وجود ارتشاح کثيف للخلايا الالتهابية المتمثلة بالخلايا اللمفاوية والبلازمية، حيث ظهرت هذه الآفات بفترات زمنية متأخرة مقارنة بالمزارع الخلوية وتفاعل سلسلة البوليمريز.

SUMMARY

In order to investigate the pathogencity, histopathological changes and clinical signs in white Swiss mice infected intraperitoneally with 3 different strains (NC-5, BPA4 and Nc1) of Neospora caninum, mice were kept under observation for 90 days after infection. The samples (blood, brain, skeletal muscle and heart) were collected at different times for diagnosis of the parasite by using Tissue culture (Vero cell, Real Time PCR and Histological sections) with observation of the clinical signs. The results showed clinical signs which manifested coat roughening, body hunching, weight loss, head tilting and impaired movement which were variable according to strain. The earlier signs appear in mice infected with NC-5 and BPA4 when comparison with mice infected with Nc1, the result of propagation of parasite from the organs collected from infected mice showed variation in Cyto Pathic Effect (CPE) in vero cell, the CPE appear in the 3^rd passage in BPA4 and NC-5 when comparison withNc1 (4^th) passage with higher titer in BPA4 when compared with other strains, the parasite appear in the blood sample in vero cell after 14 days of infected mice with NC-5 strain, the Real Time PCR result showed appearance of positive reaction in the infected cells culture infected with NC-5 and BPA4 strains. The histopathological changes appear presence of tissue cyst with prevascular cuffing and aggregation of glial cell, loss of Neuropil and infiltration of mononuclear cell in brain, the skeletal muscle showed presence of lymphocytes and plasma cell with some macrophage, the heart section showed heavy infiltration by inflammatory cells (plasma cell and lymphocytes), this histopathological changes appear delayed when compared with tissue culture and Real Time PCR.                       

Key words: Neospora caninum, mice, experimental infection.

INTRODUCTION

المقدمــة

تعد البوغة الجديدة الکلبية من الاوالي الطفيلية التي تعيش داخل الخلايا ، ويصيب هذا الطفيلي الکلاب التي تعد ثويا " نهائيا" والابقار التي تعتبر ثويا "متوسطا"، وتسبب البوغة الجديدة الکلبية خسائر اقتصادية في الأبقار نظرا لما تسببه من فقدان في الأجنة نتيجة الإجهاض وموت العجول حديثة الولادة ، وقلة في إنتاج الحليب (Dubey et al., 2007)، بالإضافة إلى ذلک تصيب البوغة الجديدة الکلبية حيوانات أخرى مثل الجاموس، الغزلان ، الأغنام ، الماعز والقيوط ، أما الحيوانات المخبرية فتختلف درجة حساسيتها للإصابة تبعا لنوعها، تعتبر الفئران المخبرية من أکثر الحيوانات الحساسة للإصابة التجريبية ومع تنوعها تختلف مدى قدرة البوغة الجديدة الکلبية لإحداث أفات مرضية فيها ، تعد الفئران السويسرية البيضاء والفئران العارية Nude mice من أکثر الأنواع حساسية للإصابة ، وهکذا فإن الفئران من أهم الحيوانات المخبرية المستخدمة لدراسة البوغة الجديدة الکلبية من عدة نواحي منها : ضراوة الذراري ، آلية حدوث المرض ، ودراسة مدى مقدار الحماية التي يوفرها اللقاح ضد الطفيلي ، حيوية الطفيلي، ودراسة الانتقال العمودي للاخماج اضافة الى دراسة مدى نجاح العلاجات ضد الطفيلي، وکذلک الدراسات المناعية والدراسات النسجية (Beck et al., 2009) .

وتعتمد شدة العلامات المرضية والآفات التي تسببها البوغة الجديدة الکلبية في الفئران على عدة عوامل منها: الاختلاف في ضراوة الذراري ، جرعة الخمج ، عدد التمريرات المستخدمة في إنماء الطفيلي على خلايا الزرع الخلوي قبل الحقن (الخمج التجريبي) (Collantes-Fermandez et al., 2006)، تتمثل العلامات المرضية بخشونة في الشعر coat roughening ، وتحدب الجسم body hunching ، وفقدان الوزن weight loss ، وعلامات عصبية مثل ميلان الرأس head tilting ، ضعف في الحرکة impaired movement  ،أو أن تکون حرکة الحيوان دائرية Circling، وشلل في الأطراف الخلفيةparalysis  وموت في الحيـوانات والتي يمکن أن تظهر على الفئـران خـلال (ن 14-30 ) يوما (Quinn et al., 2002) ، أما الآفات المرضية التي يمکن أن تسببها الإصابة فتتمثل بالتهاب الدماغEncephalitis  ، التهاب رئوي Pneumonia ، التهاب العضلات Myositis ،التهاب البنکرياس Pancreatitis والتهاب الجذور والأعصاب Radiculoneuritis (Collantes-Fermandez et al., 2004) ، وتتباين هذه الآفـات والأعـراض حسب الـذرية المستخدمـة في الخمج الجريبي وضراوتها ، إذ إن ضـراوة ذراري البوغـة الجـديدة الکلبيـة لم تعرف جميعا بعد (Hemphill et al., 2006) ، إلا أن باحثين ذکروا وجود ذراري للبوغة الجديدة الکلبية ضعيفة الضراوة مثل (NC3, NC-NOWRA, NC-Spain 1H , Nc2,Nc3) في حين عدت الذراري ( Nc1, NC-5,BPA4, BPA1, NC-Liverpool) ذراري مرتفعة الضراوة (Barber et al., 1995) ، وبالرغم من الدراسات التي توضح الاختلافات في ضراوة هذه الذراري إلا أن الجدل القائم هو عن مدى قدرتها على إحـداث الامـراضية ونوعـها في الحيوانات المختلفة (Rojo-Montejo et al., 2009).

وانطلاقا مما ورد أنفا" فقد هدفت هذه الدراسة إلى إجراء خمج تجريبي بالفئران المختبرية بذراري الطفيلي (Nc1،NC-5،BPA4) للتعرف عن الأعراض المرضية ، والآفات النسجية بالإضافة  إلى إعادة عزل الطفيلي منها لمعرفة وقت ظهوره في الأعضاء المختلفة وتشخيصه باستخدام اختبار تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي.

MATERIALS and METHODS

المـواد وطرائق البحـث

1- حيوانات التجربة: تم تربية عدد من الفئران من نوعSwiss White mice  بعد التأکد من خلوها من الطفيلي، ومن ثم تم إکثارها وانتقاء 80 أنثى فأر مخبري بعمر 6 أسابيع ، اقسمت هذه الفئران إلى 4 مجموعات کل منها 20 فأرا" ووضعت کل مجموعة منها ضمن قفص تربية مخصص لها .

2- الطفيلي: تم الحصول على ثلاثة ذراري للبوغة الجديدة الکلبية من الباحث (ألعبيدي وآخرون,2011) ، والتي تضمنت (NC-5,Nc1,BPA4) ، حيث عزلت من قبل الباحث آنف الذکر على خلايا الزرع الخلوي لخلايا کلية القرود الأفريقية الخضراء Vero cell ، شخصت وصنفت ضمن اختبار تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي وباستخدام ثلاث مشرعات للذراري المذکوره سابقا.

3- الخمج التجريبي: تم حقن کل مجموعة بذرية واحدة عن طريق الحقن بالتجويف الصفاقي Intraperitoneally بجرعة قدرها ( 2×10⁵/200 مايکروليتر) من الحيوانات التسرعية لکل فأر ، بينما حقنت المجموعة الرابعة وبنفس الطريقة بدارئة فوسفات معقمة إذ کونها مجموعة شاهد ، وخضعت الفئران تحت المراقبة لمدة 90 يوما" بعد الحقن وذلک بهدف ملاحظة أية أعراض مرضية أو حصول موت فيها (Chantal et al., 2004).

4- جمع العينات: تم جمع العينات من مجموعات الفئران بإجراء الصفة التشريحية لفأرين تظهر عليهما أعراضا" مرضية في الأيام (90,60,28,21,14,7,0) بعد الحقن ، وقد تضمنت العينات (عينات دم وضعت في أنابيب حاوية على الهيبارين أضيف لها حجم مماثل من الفايکول ومن ثم وضعت في جهاز المثفلة 2000 دورة /دقيقـة، بدرجة حرارة 4 م ە ، لمدة 10 دقائق سحبت طبقة الخلايا اللمفاوية (Buffy Coat) وحفظت في 4 م ە حتى إجراء إنماء الطفيلي) ، والأعضاء (الدماغ, القلب, العضلات الهيکلية) ، وتم ملاحظة الآفات العيانية الظاهرة على الأعضاء ومن ثم قسمت إلى نصفين , النصف الأول: أخذ جزء من کل من هذه الأعضاء بمقدار 1 غرام ووضعت في محلول دارئة فورمالين 10% لغرض الفحص النسيجي المرضي ، في حين احتفظ بالجزء الثاني في زجاجات معقمة معدة مسبقا لهذا الغرض حيث تکون محتوية على محلول دارئة الفوسفات (PBS) متعادل والحاوي على 100 وحدة دولية / 1 مل من البنسلين ج (Penicillin G) ، الستربتومايسين بمقدار 50 مايکرو غرام/ 1 مل (Streptomycin) ، وسلفات الجنتاميسين Gentamicine Sulfate  بمقدار 50 ملغم/لتر وصادات فطور متمثلة امفوتريسين ب Amphotericin B بمقدار 2.5 ملغم/ لتر وذلک لغرض عزل الطفيلي على خلايا الزرع الخلوي (Masumi et al., 2000).

5- عزل الطفيلي: تم أخذ 1 غرام من الأعضاء المضاف إليها محلول دارئ الفوسفات الحاوية على الصادات الحيوية ولکل عضو على حده ، وقطعت في هاون خزفي معقم إلى قطع صغيرة باستخدام مقص جراحي معقم ، ونقلت العينة بعد ذلک إلى أنبوبة زجاجية معقمة، أضيف إليها 2 مليلتر من محلول دارئة حاوي على 0.25% تربسين و0.025 % من ملح EDTA (Ethylene Diamin Tetra Acetic Acid) ، ووضعت الأنبوبة فوق المجانسة لستة مرات , کل مرة لمدة 2 دقيقة، حيث حضنت بدرجة 37م ە ، ثم وضع المزيج في أنابيب معقمة ووضعت في جهاز المثفلة المبردة 2000 دورة/دقيقة 4 م ە لمدة 10 دقائق ، وتم التخلص من الراشح وتم إضافة 2 مليلتر من الوسط الزرعي للنموMEM (Minimal Essential Media) إلى الراسب ، وتم مزجهما جيدا ومن ثم وضع المزيج في جهاز المثفلة، وتم إعادة هذه العملية ثلاث مرات لغرض غسل الراسب ومن ثم علق الراسب في 10 مليلتر من الوسط الزرعي للنمو MEM ليحفظ في 4 م ە لحين إجراء الإنماء على خلايا الزرع الخلوي (Nathalie, 2003).

6- خلايا الزرع الخلوي المستمر: تم استخدام خلايا زرع خلوي من نوع خلايا کلية جنين القرود الخضراء الأفريقيةVero cell  ، حيث تم الحصول عليها من قسم اللقاحات –مديرية الصحة الحيوانية في دمشق ، وتم إنماءها وإکثارها لغرض إنماء الطفيلي.

7- إنماء الطفيلي: تم إتباع طريقة (Yamane et al., 1997) ، حيث تم مزج العالق الذي تم تحضيره مسبقا في عملية عزل الطفيلي ب 10 مليلتر من خلايا کلية جنين القرود الخضراء الأفريقية ومن ثم حضنت لمدة 4 ساعات بدرجة37  م ە  وضع المزيج في أنابيب معقمة في جهاز المثفلة بمعدل 2000 دورة/دقيقة  ولمدة 10 دقائق ، ومن ثم تم التخلص من الراشح، وغسل الراسب الحاوي على الخلايا ثلاث مرات بمحلول دارئة الفوسفات المعقمة والذي يکون بدرجة حرارة 37 م ە ، ونقلت الخلايا فيما بعد إلى الحوجلة الخاصة للزرع الخلوي (Falcon سعة 50 مليلتر) ومن ثم أضيف إليها وسط النمو (Growth media) الحاوي على 10 % مصل جنين بقري و 10 غرام من مرق التربتوز الفوسفاتي /لتر Tryptose phosphate broth والکلوتامينGlutamine  0.854 غرام/لتر , بيکاربونات الصوديوم 1.5 غرام/لتر ، بنسلين ج 100 وحدة دولية/1 مل والستربتومايسين 100 مايکرو غرام /1 مل وسلفات الجنتاميسين Gentamicine Sulfate بمقدار 50 ملغم/لتر وصادات فطور من امفوتريسين ب Amphotericin B بمقدار 2.5 ملغم/ لتر ، وتم تحضين الخلايا في 37 م ە ، 5% CO2، وتم مراقبة الخلايا يوميا بفحصها تحت المجهر المعکوس ، ويراعى استبدال الوسط کل 5 أيام وبعد ذلک يتم حصاد الطفيلي باستخدام المکشطة الخاصة بازالة الخلايا ومن ثم يتم وضع الوسط الحاوي على الطفيلي في أنبوبة معقمة ويثفل 2000 دورة /دقيقة 4 م ە لمدة 10 دقائق، ويهمل الراشح ويعلق الراسب في 1 مليلتر من دارئة فوسفات معقمة ويمرر السائل في محقنة طبية معقمة سعة 1 مليلتر وذات إبرة رفيعة ، ومن ثم يوضع السائل في المثفلة بمعدل 500 دورة /دقيقة لمدة 10 دقائق 4 م ە ويهمل الراسب ومن ثم يتم تعداد کمية الحيوانات التسرعية في الراشح باستخدام شريحة تعداد کريات الدم الحمر (شکل-1-) ، حيث يتم إجراء تمريره واحدة کل 20 يوما من التحضين ولستة تمريرات.

8- استخلاص ألدنا DNA Extraction: تم إجراء استخلاص ألدنا حسب تعليمات الشرکة المصنعة للعتيدة (OMEGA bio kit).

- تحضير المحاليل:

* تحضير أنزيم البروتينازK: تم إذابة الأنزيم والبالغة کميته 120 ملغم في 4.8 مليلتر من دارئة حفظ أنزيم البروتيناز Proteinase storage buffer.

* تحضير دارئة الغسلSPM Wash buffer : تم إضافة 42 مليلتر من الايتانول المطلق 100% إلى 60 مليلتر من دارئة الغسل لتکون جاهزة للاستخدام.

* تحضير دارئة MP: تمت إضافة 60 مليلتر من الايتانول المطلق 100% إلى 40 مليلتر من دارئة MP لتکون جاهزة للاستخدام.

- استخلاص ألدنا للطفيلي DNA من المزارع الخلوية:

تم حصاد الخلايا من حوجلة الزرع الخلوي باستخدام مکشطة الخلايا المطاطية cell scraper، وتم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول دارئة الفوسفات البارد (4م ە) ، وتم تعليقها في دارئة الفوسفات البارد (4 م ە) 180 مـايکروليتر، ثم أضيف 20 مايکروليتر من إنزيم بروتينازK (Proteinase K) (25 mg /ml)، ومزج جيدا وحضن في الحمام المائي الهزاز 55 م ە لمدة 10 دقائق ، ثم نقلت العينة في أنابيب ابندورف Eppendorf حجم 1.5 مليلتر معقمة ، وتم إضافة 200 مايکروليتر من دارئة MSL ومزج جيدا وحضن 10 دقائق عند درجة حرارة 70 م ە، ثم ترک الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، وأضيف الايتانول المطلق 100% بمقدار 260مايکروليتر مع إضافة 10 مايکروليتر من الجزيئات المغناطيسية Mag –Bind Particules و 10 مايکروليتر من دارئة LPA مزج جيدا وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وبعد ذلک وضع الأنبوب فوق جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 7 دقائق ،تم إزالة السائل الراشح باستخدام ماصة دقيقة ، وإضافة 400 مايکروليتر من دارئة MP ومزج جيدا ثم حضن لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ووضع الأنبوب فوق جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 7 دقائق وتم التخلص من الراشح باستخدام ماصة دقيقة وأضيف 400 مايکروليتر من محلول دارئة الغسلSPM Wash Buffer مع المزج الجيد وحضن 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ووضعت بعدها الأنبوبة على جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 7 دقائق ، وتم التخلص من الراشح باستخدام ماصة دقيقة وأعيدت عملية الغسل بدارئة الغسل SPM Wash Buffer 400 مايکروليتر، وتم التأکـد من خلـو الأنبوبة من أي کميـة من الراشح وأضيف دارئة الشطف Elution Buffer 200 مايکروليتر لشطف ألدنا عن الجزيئات المغناطيسية مع مراعاة المزج الجيد ومن ثم حضنت 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وضعت الأنبوبة بعدها فوق جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 7 دقائق وسحب الراشح الحاوي على جزيئات ألدنا المستخلصة ونقل إلى أنبوبة ابندورف Eppendorf حجم 1.5 مليلتر معقمة أخرى، وحفظ الأنبوب في -70 م ە لحين إجراء اختبار تفاعل سلسلة البوليمريز عليه.

9- تفاعل سلسلة البوليمريز –ذو الوقت الحقيقي Real Time PCR

تم استخدام العتيدة المنتجة من قبل شرکة (Genekam Biotechnology AG Germany) والتي تعتمد على صبغات ومضانية Fluorogenic بنوعين هما:

- (6-carboxy tetramethyl rhodamine(reporter))

- (Carboxy –fluorescein (quencher)).

9-1- المحاليل والمواد المستخدمة في تفاعل البوليمريز 

عبارة عن مزيج تفاعل يحتوي على کل مکونات التفاعل مع المشرعات وقالب ألدنا المراد اختباره، ويتکون مزيج التفاعل لکل عينة حجم 25 مکرولتر من المواد التالية:

9-2- المشرعات أو البادئات: Primers

صنعت هذه المشرعات من قبل شرکة GenBank Accession. وتم انتقاء هذه المشرعات من أجل تضخيم المورثات لکل من الذراري(NC-5, Nc1and BPA-4) (Nathalie, 2003) وقد تضمنت 3 أزواج من المشرعات وکما يلي:

9-3- خطوات عمل تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي:

أجري اختبار تفاعل البوليمريز المتسلسل المتعدد حسب الطريقة الموصوفة من قبل (Esther et al.,2002) ، حيث اجري الاختبار في حجم تفاعل کلي من 25 مکرولتر داخل أنابيب سعة 200 مکرولتر وأضيف إليها 0.2 مکرولتر من کل بادئ من البادئات  Primersو5 مکرولتر من قالب ألدنا Template DNA وباقي الحجم من محلول مزيج التفاعل الجاهز Master mix الحاوي على جميع مکونات التفاعل باستثناء البادئات وقالب ألدنا. وبعد ذلک وضعت الأنابيب في المبلمر الحراري (Thermocycler). وأجريت عملية التضاعف  Amplificationبواسطة جهاز المبلمر الحراري المبرمج على خمسين دورة بعد خطوة المسخ Denaturating  95ºم لمدة 10 دقائق. کل دورة شملت مسخ عند درجة حرارة 94 ºم لمدة خمسة ثواني 25 دورة، ارتباط Annealing البادئ أو المشرع بدرجة 60 ºم لمدة15 ثانية، واستطالة Elongation عند درجة حرارة 72 ºم لمدة 15 ثانية، ثم 25 دورة مسخ 94 ºم لمدة 5 ثواني , ارتباط 66 ºم لمدة 5 ثواني , استطالة 72 ºم لمدة 45 ثانية.

11- الفحص النسيجي المرضي:

تم إجراءه حسب الطريقة التي ذکرها (Shibahara et al., 1999) ، باستخدام صبغة الهيماتوکسلين والايوسين.

RESULTS

النتائـــج

1- العلامات المرضية :

تبين من خلال مراقبة مجاميع الفئران لمدة 90 يوما والتي خمجت بذراري البوغة الجديدة الکلبية ظهور أعراض_" مرضية مختلفة متمثلة ( خشونة في الشعر coat roughening ، تحدب الجسم body hunching ، فقدان الوزن weight loss ،علامات عصبية مثل ميلان الرأس head tilting وضعف في الحرکة impaired movement) (الأشکال 3,2,1 ) وذلک حسب نوع الذرية التي تم بها الخمج التجريبي بالإضافة إلى حصول موت لبعض الفئران ، أما مجموعة الشاهد والتي تم إعطاءها دارئة الفوسفات فلم يظهر عليها أي أعراض مرضية.جدول-1-.

جدول 1: يبين الأعراض المرضية الظاهرة على مجاميع الفئران المحقونة بذراري البوغة الجديدة الکلبية

العلامات التالية تعني (-) عدم ظهور ألأعراض المرضية المبينة ,(+) ظهور الأعراض المرضية المبينة

2-تنمية الطفيلي:

بينت نتائج تنمية الأعضاء المختلفة لمجاميع الفئران التي حقنت بالذراري الثلاثة على خلايا الزرع الخلوي ، ظهور أفات مرضية خلوية وتمريرات متباينة حسب العضو والذرية ، حيث بينت النتائج ظهور فجوات في خلايا الزرع الخلوي للذريتين NC5 و BPA4 ابتداءا من التمريرة الثالثة ، أما الذرية Nc1 فظهرت الفجوات في خلايا الزرع الخلوي وذلک في التمريرة الرابعة ، أما التمزق في الخلايا فظهر في التمريرة الرابعة للذريتين NC5 و BPA4 ، في حين ظهر الطفيلي في التمريرة الرابعة للذريتين  NC5و BPA4 ، وفي التمريرة الخامسة للذرية Nc1 ، وبين معيار الذرية وجود ارتفاعا "متباينا" بين الذراري حيث کان أعلى معيار للذرية NC5 ابتداء في التمريرة الرابعة ، تليه الذرية BPA4 ، في حين کان اقل معيار للذرية Nc1 ابتداءا من التمريرة الخامسة ، جدول-2-.

جدول 2: يبين التغيرات المرضية الخلوية Cyto Pathic Effect على خلايا الزرع الخلوي لخلايا کلية أجنة القرود الأفريقية الخضراء المحقونة بالذراري الثلاثة

بينت نتائج الکشف عن الطفيلي في المزارع الخلوية بعد حقنها بأعضاء الفئران المصابة بالذراري الثلاث ، حيث تبين وجود للطفيلي للذرية NC5 في الدم بعد (28,21,14) يوما من الحقن, بينما لوحظ وجوده في بقية الأعضاء (الدماغ , القلب والعضلات الهيکلية) بعد 28 يوما من الحقن ، کما لوحظ وجود الطفيلي في الفئران التي تم حقنها بالذرية Nc1 في عينات الدم بعد 28 يوما من الحقن ، في حين لوحظ وجود الطفيلي في بقية الأعضاء بعد 60 يوما من الحقن ، أما بالنسبة الذرية BPA4 فلوحظ وجود الطفيلي في الفئران المحقونة بها بعد 21 يوما من الحقن في عينات الدم ، بينما ظهر في بقية الأعضاء بعد 28 يوما من الحقن، جدول-3-.

جدول 3: يبين ظهور الطفيلي في الأعضاء المختلفة للفئران قبل وبعد الحقن بالذراري الثلاث باستخدام المزارع الخلوية

3- تفاعل سلسلة البوليمريز:

في حين بينت نتائج الکشف عن الدنا للطفيلي باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي في المزارع الخلوية المحقونة بأعضاء الفئران المصابة بالذراري الثلاثة ، حيث تبين وجود الدنا للطفيلي في الدم بعد 14 يوما من الحقن بالذرية NC5 ، في حين أظهرت الأعضاء (الدماغ  والعضلات الهيکلية ) نتيجة ايجابية بعد 21 يوما من الحقن بالذرية أنفة الذکر ، بينما أظهرت عينات القلب نتيجة ايجابية بعد 28 يوما.

أما الذرية Nc1 فأظهرت النتائج أن الدنا للطفيلي ظهر في عينات (الدم , الدماغ والقلب) بعد 21 يوما من الحقن ، في حين ظهر في اليوم 28 بعد الحقن في عينات العضلات الهيکلية .

وأظهرت نتائج الکشف عن الدنا للطفيلي للذرية BPA4 وجود نتائج ايجابية بعد 14 يوما للحقن في عينات الدم ، بينما أظهرت النتائج وجود الدنا للذرية آنفة الذکر في عينات القلب والعضلات الهيکلية بعد 21 يوما من الحقن ، أما عينات الدماغ فأظهرت نتائج ايجابية للدنا للطفيلي بعد 28 يوما من الحقن , الجدول-4-.

جدول 4: يبين ظهور الطفيلي في الأعضاء المختلفة للفئران قبل وبعد الحقن بالذراري الثلاث باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي

4- الفحص النسيجي المرضي:

بينت نتائج الفحص النسيجي لأعضاء الفئران التي تم جمع الأعضاء منها والمحقونة بالذراري الثلاث وجود أفات نسجية متباينة الشدة بالإضافة إلى التباين في وقت ظهورها حسب الذرية والعضو ، تمثلت هذه الآفات في الدماغ بوجود الأکياس النسجية مع  استکفاف وعائي preivascular cuffing ووجود بؤر لتجمعات الخلايا الدبقية Multifocal gliosis وخلايا أحادية النواة مع فقدان اللبد العصبي Neuropil (الأشکال6,5,4 ) ، أما في العضلات الهيکلية فقد تبين وجود تجمعات من الخلايا اللمفاوية والبلازمية وبعض الخلايا البلعمية (الشکل 7) بينما کانت آفات القلب متمثلة بوجود أرتشاح کثيف للخلايا الالتهابية المتمثلة بالخلايا اللمفاوية والبلازمية (الشکل 8), جدول(5)

جدول 5: يبين ظهور الطفيلي في الأعضاء المختلفة للفئران قبل وبعد الحقن بالذراري الثلاث باستخدام الفحص النسيجي

DISCUSSION

المناقشة

بينت نتائج هذه الدراسة ظهور علامات مرضية متباينة على مجموعات الفئران التي طبق عليها الخمج التجريبي ، حيث تم حقن حيوانات التجربة (الفئران) بالذراري الثلاث للبوغة الجديدة الکلبية ، حيث عانت الفئران المحقونة بالذرية NC5 حصول خشونة بالشعر بعد 14 يوم من الإصابة وظهرت العلامات العصبية بعد 28 يوما من الإصابة ، مع حدوث موت بعد 21 أو 28 يوما" من تطبيق الخمج التجريبي ، أما الذرية Nc1 فعانت مجموعة الفئران المحقونة فيها من علامات مرضية متأخرة بعض الشي عن الذريتين الاخريتين ، حيث أظهرت الفئران علامات مرضية بعد 21 يوما" من الخمج , والموت في اليوم 28 من تطبيق الخمج ، أما مجموعة الفئران التي حقنت بالذرية BPA4 فقد عانت من خشونة في الشعر بعد 14 يوما" ، بينما ظهرت الأعراض العصبية بعد 60 يوما.

إن هذه التباينات ما بين الذراري في قابليـة إحداثهـا للعلامات المرضية يعـود للاختـلاف في ضراوتهـا بالإضافـة إلى قدرة کل ذرية في الانتشار والتکاثـر والتفاعـل مع أنسجـة جسم الثوي المتوسط ، حيث ذکر الباحثون (Regidor-Cerrillo et al.,2010)، إن لذراري البوغة الجديدة الکلبية اختلافات في قابلية إحداثها للامراضية بسبب الانماط المتعددة للضراوة ،علما" أن الذراري التي شملتها الدراسة کانت معزولة من نفس المنطقة الجغرافية ، هذا إضافة إلى الاختلاف في الضراوة عند تغيير الثوي المخبري المستخدم في الدراسة مما يعطي رؤية أوسع عن مدى تأثر ذلک بظروف التجربة. وبينت نتائج تنمية أعضاء الفئران ولست تمريرات على خلايا الزرع الخلوي  والتي خضعت للخمج التجريبي ، ظهور اختلاف في سرعة ظهور الآفات الخلوية المرضية مع الاختلاف في معايير کل ذرية ، وهذا يتفق مع ما ذکره (Barley et al., 2006) ، حيث بين وجود اختلافات ما بين بعض ذراري البوغة الجديدة الکلبية بسبب الاختلاف في قابليتها لغزو خلايا الزرع الخلوي بالإضافة إلى تأثر کل ذرية بنوع خلايا الزرع الخلوي المستخدمة في التنمية ، وهذا ما يمکن أن يشير إلى وجود انساب أو صلات وعلاقات مختلفة لخصوصية ذراري البوغة الجديدة الکلبية للنمو على خلايا الزرع الخلوي المختلفة بالإضافة إلى الاختلاف في قابلية إحداث الذرية للتغيرات المرضية الخلوية على خلايا الزرع الخلوي، إذ بين (Cheah et al., 2004) ، في دراستهم الاختلاف ما بين نوعين من الذراري للکشف عن الاختلافات فيما بينهما لإحداث تمزق خلايا الزرع الخلوي، حيث وجد أن تأخر الذرية لإحداث ذلک يؤثر على سرعة انتشار الذرية في خلايا الزرع الخلوي مما يؤخر ظهور الآفات بسرعة. بينت النتائج في مجموعة الفئران ظهور للطفيلي بالدم باستخدام خلايا الزرع الخلوي بعد 14 يوم بالنسبة للذريتين NC5 و BPA4، أما فيما يتعلق بالذرية Nc1 فکان أول ظهور للطفيلي بعد 28 يوما" من تطبيق الخمج ، وتم الکشف عن الطفيلي في باقي الأعضاء بعد ذلک الوقت ،إن هذه الاختلافات في زمن ظهور الطفيلي في الأعضاء يعود إلى الاختلاف في قابلية الذراري لغزو خلايا المضيف لکل عضو على حده ، هذا بالإضافة إلى الاختلاف في قابلية کل ذرية لإکمال دورة تکاثرية کاملة مما يؤثر على سرعة ظهوره بالأعضاء المختلفة (Javier et al., 2011) ، إن ظهور الطفيلي في الدم أولا" وقبل الأعضاء يعود إلى أن هذا السائل يعد طريق الانتشار الرئيس للحيوانات التسرعية إلى بقية أعضاء الجسم ، حيث ذکر (Long et al., 1998) ، وجود الحيوانات التسرعية بعد 14 يوما" في بطانة الأوعية الدموية، أما الاختلاف في وقت ظهور الطفيلي في الأعضاء ، فيتعلق بقابلية الذراري للانتشار في الأعضاء المختلفة استنادا لقابلية للانتشار والتکاثر فيها بالإضافة إلى قدرتها على اختراق الموانع الحيوية في أنسجة جسم ألثوي کالمانع الدموي – الدماغي Blood-Brain Barrier (Lopez-Perez et al., 2006). أما نتائج الکشف عن ألدنا للطفيلي في المزارع الخلوية المحقونة بالأعضاء المختلفة لمجوعات الفئران والتي تم جمع النماذج منها بأيام مختلفة ، فقد بينت النتائج وجود تباينات بين الذراري بالإضافة إلى وجود تباينات عن المزارع الخلوية، حيث کانت العينات الايجابية أعلى باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز ذو الوقت الحقيقي ، ويعود السبب في ذلک للدقة والحساسية العالية التي يتمتع بها هذا الاختبار حيث بين (Pinikiatisakul et al., 2008) ، إن هذا الاختبار له القدرة على الکشف عن 0.1 من الحيوانات التسرعية لکل تفاعل والتي تعادل 10fg من قالب ألدنا للبوغة الجديدة الکلبية ، حيث بين وجود عينات سلبية للبوغة الجديدة الکلبية باستخدام ثلاث طرائق تشخيصية هي (المزارع الخلوية، الکيمياء النسيجية المناعية والفحص النسيجي المرضي) ، إلا أن هذه العينات أعطت نتائج ايجابية باستخدام تفاعل سلسلة البوليمريز.

فيما بينت نتائج الفحص النسيجي لأعضاء الفئران المحقونة تأخرا في ظهور الآفات النسجية وتباينا في وقت ظهورها حسب نوع الذرية , وهذا يختلف عما ذکره (Barley et al., 2009) ، ويعود السبب في ذلک الى نوع الذرية المستخدمة وحجم الجرعة التي خمج بها من الحيوانات التسرعية.

أن عدم التوافق في نتائج الکشف عن ضراوة الذراري المختلفة مع دراسات أخرى قد يفسر بأسباب عديدة منها : الاختلاف سواء في نوع الفئران أو في ظروف التجربة ، ويلجأ بعض الباحثين إلى استخدام مثبطات مناعية وبغرض ضمان إحداث الامراضية أو لتوضيحها بصورة اکبر بالإضافة إلى أن تأثر ذراري البوغة الجديدة الکلبية بنوع المزارع الخلوية المنماة عليها بعدد التمريرات قبل إحداث الاخماج التجريبية يلعب دورا" جوهريا" ومهما" في هذا الجانب.

REFERENCES

المراجـع

المراجع العربيةArabic References

العبيدي, وسن , القطرنجي, محمد محسن والخالد, عبد الکريم (2011): عزل وتشخيص جزيئة الدنا للبوغة الجديدة الکلبية من الأبقار المصابة طبيعيا لأول مرة في سوريا. قيد النشر مجلة جامعة الفرات.

المراجع الانکليزيةEmglish References:

Barber, J.S.; Holmdahl, O.J.; Owen, M.R.; Guy, F.; Uggla, A. and Trees, A.J. (1995): Characterization of the first European isolate of Neospora caninum .Parasitology,111: 563-568.

Barley, P.M.; Wright, S.; Sales, G.; Chianin, F.; Buxton, D. and Innes, E.A. (2006): Long-term passage of tachyzoites in tissue culture can Attenuate virulence of Neospora caninum in vivo. Parasitology, 133: 421-432.

Beck, H.P.; Blake, D.; Darde, M.L.; Flager, I.; Pedraza-Diaz, S.; Regidor-Cerrillo, J.; Gomez-Bautista, M.; Ortega-Mora, L.M.; Putignani, L.; Shiels, B.; Tait, A. and Weir, W. (2009): Molecular approach To diversity of populations of apicomplexan parasites. Int. J. Parasitol, 39: 175-189.

Chanatal, R.; Thierry, L.; Francois, D.M.; Charles, F. and Betrand, L. (2004): Survival, immune responses and tissue cyst Production in outbred (Swiss white) and inbred (CBA/Ca) Strains of mice experimentally infected with Neospora Caninum tachyzoites.Vet. Res, 35: 225-232.

Cheah, T.S.; Mattsson, J.G.; Zaini, M.; Sani, R.A.; Jakubek, E.B.; Uggla, A.; and Chandraawathani, P. (2004): Isolation of Neospora caninum From a calf in Malaysia. Vet. Parasitol, 29: 263-269.

Collantes-Fernandez, E.; Alvarez-Garcia, G.; Perez-Perez, V.; Pereia-Bueno, J. and Ortega-Mora, L.M. (2004): Characterization and pathology and parasite load in outbred and inbred Mouse models of chronic Neospora caninum infection. J. Parasitol., 90: 579-583.

Collantes-Fermandez, E.; Lopez-Petez, I.; Alvarez-Garcia, G. and Ortega-Mora, L.M. (2006): Tempral distribution and parasite Load kinetics in blood and tissue during Neospora caninum Infection in mice. Infect Immune, 74: 2491-2494.

Dubey, J.P.; Schares, G. and Ortega-Mora, L.M. (2007): Epidemiology and control of neosporosis and Neospora caninum. Clin Microbiol. Rev., 20: 232-367.

Esther, C.F.; Angel, Z.; Gema, A.G. and Luis, M.O. (2002):Quantitative detection Of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimental Infected Mice by Real-Time PCR.Journal Of Clinical Microbiolog,40(4):      1194-1198.

Hemphill, A.; Vanbufen, N. and Naguleswaaran, A. (2006): Cellular and Immunological basis of the host parasite relationship During infection with Neospora caninum. Parasitology, 133: 261-278.

Javier, R.; Mercedes, G.; Itsaso, S.; Gorka, A.; Gema, A.; Itziar, D. and Luis, M.A. (2011): In vitro invasion efficiency and intracellular and Proliferation rate comprise virulence –related phenotypic Traits of Neospora caninum. Vet. Res., 42: 41-52.

Long, M.T.; Bszler, T.V. and Mathison, B.A. (1998): Comparison of Intracerebral parasite load, lesion development, and systemic Cytokins in mouse strains infected with Neospora caninum. J. Parasitol., 90: 579-583.

Lopez-Petez, C.; Risco-Castillo, V.; Collantes-Fermandez, E. and Ortega-Mora, L.M. (2006): Comparative effect of Neospora caninum Infection in balb/c mice ate three different gestation period. J. parasitol, 92: 1286-1291.

Masumi, S.; Hisayo, K.; Yukiko, T.; Chun-Ho, P.; Takehito, M.; Akinori, S. and Takashi, U. (2000): Isolation of Neospora caninum from the brain of a naturally infected adult dairy cow. Veterinary Parasitology, 90: 247-252.

Nathalie, V. (2003): Hiding inside the host: Development and application of Neospora caninum bradyzoites in vitro culture. PhD. Thesis, University of Basel, Germany, PP: 29-34.

Pinikiattisakul, S.; Mattsson, J.G. and Lunden, A. (2008): A quantitative Analysis of parasite DNA in blood of immunized and native Mice after infection with Neospora caninum. Parasitology, 135: 175-182.

Quinn, H.F.; Miller, C.M.; Ryce, C.; Windsor, P.A. and Ellis, J.T. (2002): Characterization of an outbred pregnant mouse model of Neospora caninum infection. J. Prarsitol, 88: 691-696.

Regidor-Cerrillo, J.; Gomez-Bautista, M.; Del Poza, I.; Jimenez-Ruiz, E.; Aduriz, G. and Ortega-Mora, M. (2010): Influence of Neospora Caninum intra-specific variability in the outcome of infection in a Pregnant Balb/c mouse model.Vet. Res., 41: 52-58.

Rojo-Montejo, S.; Collantes-Fermandez, E.; Regidor-Cerrillo, J.; Alvarez-Garcia, G.; Marugan-Hernandez, V.; Pedraza-Diaz, S.; Blanco-Murcia, J.; Prenafeta, A. and Ortega-Mora-L. M. (2009): Isolation and characterization of bovine isolate of Neospora Caninum with low virulence. Vet. Parasitol, 159: 7-16.

Yamane, I.; Kokuho, T.; Shimura, K.; Eto, M.; Shibahara, T.; Haritani, M.; Ouchi, Y.; Sverlow, K. and Conrad, P.A. (1997): In Vitro isolation and Characterization of a bovine Neospora Species in Japan. Res. Vet. Sci., 63: 77-80.

Shibahara, T.; Kokuho, M.; Eto, M.; Haritani, T.; Hamaoka, K.; Shimura, K.; Nakamura, Y. and Yamane, I. (1999): Pathological and Immunological finding of athymic nude and congonic wild Type Balb/c mice experimentally infected with Neospora Caninum. Vet. Pathol., 36:      321-327.