A FIELD STUDY TO TRACE THE MATERNAL IMMUNITY OF CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA IN BROILER CHICKEN

A FIELD STUDY TO TRACE THE MATERNAL IMMUNITY OF CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA IN BROILER CHICKEN

KIFAH NASHAR^* and ANOUAR ALOMAR^**

^* Fact. of Vet. Med.-Albaath University.

^** Fact. of Vet. Med.-Albaath University.

Email: nasharvet@gmail.com

دراسة حقلية لتتبع مستويات المناعة الأمية في صيصان دجاج اللحم لمرض فقر الدم المعدي في الدجاج

کفاح نشار ، أنـور العمـر

Email: gfnasharvet@gmail.com

أجريت هذه الدراسة على قطيعي دجاج لحم ، حيث قسمت أفراد التجربة إلى مجموعتين ، المجموعة الأولى صيصان دجاج لحم ناتجة من أمات غير محصنة ، أما أمات المجموعة الثانية صيصان دجاج لحم ناتجة من أمات محصنة باللقاح الحي المضعف لمرض فقر الدم المعدي.

تمت الدراسة المصلية باستخدام اختبار الاليزا غير المباشر لتتبع مستويات المناعية الأمية وانحدارها في مجموعتي التجربة ، وقد أوضحت النتائج أن مستويات المناعة الأمية في صيصان المجموعة الثانية کانت أعلى مما هي عليه في صيصان المجموعة الأولى ، کما أجريت مقارنة معامل الاختلاف (CV) الذي يعبر عن تجانس مستوى مناعة القطيع فوجد أن تجانس مستوى المناعة في صيصان المجموعة الثانية کان أعلى مما هو عليه في صيصان المجموعة الأولى ، کما تمت مقارنة نسبة انحدار مستويات المناعة الأمية لمرض فقر الدم المعدي عند الدجاج في مجموعتي التجربة ، فوجد أن نسبة الانحدار کانت أعلى في المجموعة الأولى مقارنة مع المجموعة الثانية. قد أسفرت نتائج هذه الدراسة عن أهمية تحصين الأمات ضد مرض فقر الدم المعدي للحصول على صيصان تتميز بمستوى جيد من المناعة وواقٍ ضد الإصابة بمرض فقر الدم المعدي.

INTRODUCTION

المقدمـة

أفادت التقارير بوجود فيروس فقر الدم المعدي في قطعان الدجاج منذ عام 1970م  (Jakowski et al., 1970)، وتم عزله لأول مرة في اليابان عام 1979م ، حيث تم عزل العترة  Gifa-1من قبل العالم يواسا وزملاؤه (Yuasa et al., 1979).

وفي عام 1983م رصد يواسا وزملاؤه تکاثر الفيروس في خطوط خلوية محضرة من أرومات الخلايا اللمفاوية الدجاجية مسبباً تغيرات مرضية خلوية CPE  (Yuasa et al., 1983a).

وقد أشارت تقارير مصلية عديدة إلى وجود المرض في معظم بلدان العالم التي تنتشر فيها تربية الدواجن، وقد عُزل الفيروس في کلٍ من اليابان والصين واستراليا ونيوزيلندا وجنوب إفريقيا (Roussan, 2006). وصُنِف ضمن عائلة فيروسات سيرکو Circoviridae والتي تضم ثلاثة أجناس هي جنس سيرکوفيروس circovirus الذي يضم نوعين هما سيرکوفيروس الخنزيري، وسيرکوفيروس المسبب لمرض المنقار والريش الببغائي (BFDV) psittacine beak and feather disease، وجنس سيکلوفيروس Cyclovirus الذي يصيب الحشرات، وجنس جيروفيروس Gyrovirus والذي يسبب مرض فقر الدم المعدي عند الدجاج (Mankertz, 2008).

لُوحظ على الطيور المصابة بالمرض الشحوب والإجهاد وانخفاض في الکسب الوزني، ولکن العَرَض الأهم هو فقرُ دمٍ يبلغ ذروته بعد (14-16) يوماً من الخمج، وتتعافى الطيور المصابة بفقر الدم بشکل تام من الإجهاد وفقر الدم بعد (20-28) يوماً من الإصابة (Yuasa et al., 1979)، ويمکن أن يحدث نفوق الطيور المصابة في الفترة ما بين (12-28) يوماً من حدوث الخمج وهو لا يتجاوز30% (Goryo et al., 1985)، کما يلاحظ من خلال تشريح الطيور المصابة بالمرض ضمور في غدة التيموس (Goryo et al., 1985)، وضمور في نقي العظام، وتکون الإصابة أکثر وضوحاً في نقي عظم الفخذ، ويصبح نقي العظام المتأثر ذا قوام دهني ولون مصفر أو وردي، أما بالنسبة لجراب فابريشيوس فيبدو أقل تأثراً بالفيروس، کما ويلاحظ نزف على الغشاء المخاطي للمعدة الغدية، والذي قد يلاحظ أيضاً على الجلد وتحت الجلد (Taniguchi et al., 1983)، أما الکبد فيظهر عليه علامات توذم وتبرقش (Goryo et al., 1989).

أما بالتشريح النسيجي المرضي فيلاحظ ضمور لمفاوي متعمم، حيث يسبب المرض کبتاً مناعياً (Yuasa, 1983).

ينتقل المرض عامودياً وأفقياً (Yuasa et al., 1983b)، حيث يتم الانتقال العمودي للفيروس عن طريق بيض التفريخ الذي يعتبر الطريق الأکثر أهمية في انتقال العدوى (Chettle et al.,1989).

إن التحصين ضد المرض باستراتيجياته الحالية يعتمد على تأمين مناعة عالية للصيصان الصغيرة ضد فيروس فقر الدم المعدي وذلک بتحصين قطعان الأمات بهدف الحد من حدوث المرض في الصيصان النامية (Engström, 1999) .أما المناعة العمرية فإنها تتطور خلال الأسبوع الأول من العمر وتکتمل بعمر ثلاثة أسابيع (Yuasa and Imai,1986).

تؤمن الأضداد الأمية مناعة واقية للصيصان ضد خمج فيروس فقر الدم المعدي وتستمر هذه الحماية لمدة ثلاثة أسابيع (Otaki et al., 1992)، وإن ارتفاع مستوى الأضداد النوعية عند الأمات يؤدي إلى رفع مستوى حماية الصيصان الناتجة من تلک الأمات (Pagè-Manté et al., 1997).

إن الأضداد المناعية الأمية ضد خمج فقر الدم المعدي تقي الصيصان بشکل فعال من المرض شريطة عدم وجود کبت مناعي من مسببات فيروسية أخرى مثل الخمج بمرض التهاب الجراب المعدي (Yuasa et al., 1980).

MATERIALS and METHODS

مواد وطرائق العمل

مواد البحث:

أ- الطيور:

1- طيور المجموعة الأولى: قطيع صيصان دجاج لحم أخذت من أمات غير محصنة ضد مرض فقر الدم المعدي.

2- طيور المجموعة الثانية: قطيع صيصان دجاج لحم أخذت من أمات محصنة باللقاح الحي لمرض فقر الدم المعدي.

ب- الأدوات المخبرية: محاقن سعة 4 مل- أنابيب زجاجية سعة 20 مل تستخدم لتثفيل عينات الدم- قطن وکحول طبي- أنابيب ابندورف لحفظ عينات المصل في المجمدة- رؤوس ماصة دقيقة بلاستيکية- ماصات دقيقة مفردة ومتعددة الرؤوس- حافظة لنقل عينات الدم- ماء مقطر- مؤقت زمني- مثفلة مبردة - جهاز قارئ اليزا- مجموعة تشخيصية للکشف عن أضداد مرض فقر الدم المعدي من شرکة (SYNBIOTICS) تتألف من :

1- خمسة أطباق 96 حفرة ثبت عليها مستضد خامل لفيروس فقر الدم المعدي CAV antigen coated plate.

2- محلول التمديد Dilution Buffer.

3- محلول إيقاف التفاعلStop Solution .

4- محلول الغسيل Wash Solution.

5- الشاهد الإيجابي CAV Positive Control Serum.

6- الشاهد السلبي Normal Control Serum.

7- محلول الرکيزة اللونية ABTS-Hydrogen peroxide Substrate Solution.

8- محلول الاقتران المرتبط بالأنزيم Goat anti-Chicken IgG (H+L) Peroxidase Conjugate Solution .

طرائق العمل:

تمت تربية قطيعي التجربة في ظروف مشابهة للظروف الحقلية لمحاکاة الواقع الحقلي مع ملاحظة الأخذ بجميع احتياطات الأمن الحيوي وظروف التربية الجيدة،جمعت عينات الدم من طيور المجموعتين عن طريق الوريد الوداجي باستخدام محاقن سعة 3مل حيث تم الجمع في عمر يوم واحد ثم سبعة أيام ثم في عمر أربعة عشر يوم.

نُقلت عينات الدم في حافظة مبردة إلى المختبر، حيث ثُفلت في أنابيب زجاجية سعة 20 مل بمعدل 2500 د/د لمدة عشرة دقائق، ووزع المصل في أنابيب ابندورف ورقمت ووضع عليها تاريخ الجمع والمصدر وحفظت في التجميد العميق على الدرجة -20 م°، لحين إجراء اختبار الاليزا عليها باستخدام مجموعة تشخيصية للکشف عن الأضداد النوعية لفقر الدم المعدي التجاري من شرکة (Synbiotic Corporation, USA).

وحسب تعليمات الشرکة المصنعة أنه عندما تکون قيمة S/P≤0.349  تعتبر هذه العينة ذات معيار من الأضداد صفراً (zero titer)، وعندما تکون قيمة S/P≥ 0.350تعتبر عينة ايجابية أي يکون معيار الأضداد أکبر أو يساوي 1472.

ملخص طريقة عمل اختبار الإليزا وقراءة النتائج:

أُخرجت الکواشف والمصل المراد اختباره وترکت في درجة حرارة الغرفة (22-27مْ) وتم رج المصل جيداً قبل الاستعمال باستخدام جهاز الرج Vortex.

1- تمديد المصل:

 تم التمديد الأولي للمصل في طبق ذي 96 حفرة غير مغطاة بالمستضد، حيث يتم إضافة 250 ميکرولتر من محلول التمديد إلى جميع الحفر عدا (A1-A2-A3-H10-H11-H12)، ثم يتم إضافة 5 ميکرولتر من عينة المصل في الحفرة المخصصة لها وفق ورقة العمل التي رسمت لطبق الإليزا ثم تمزج جيداً بحيث تکون نسبة التمديد في هذه المرحلة 50:1.

2-  تمديد الشاهد الإيجابي والسلبي: 

جُهز الشاهد الإيجابي والسلبي في أنابيب ابندورف حيث وُضع 250 ميکرولتر من محلول التمديد وأضيف لها 5 ميکرولتر من الشاهد الإيجابي وبنفس الطريقة جُهز الشاهد السلبي حيث يصبح التمديد 50:1.

3- تجهيز محلول الاقتران المرتبط بالأنزيم المقترن Conjugate:

يوضع في حوجلة 10 مل من محلول التمديد ويضاف لها 100 ميکرولتر من محلول الاقتران المرتبط بالأنزيم ومزجت جيداً للحصول على تمديد 100:1 هذه الکمية تکفي لطبق إليزا 96 حفرة.

4- تجهيز محلول الغسيل:

 يضاف 15 مل من محلول الغسيل إلى 285 مل من الماء المقطر، ثم يمزج جيداً لنحصل على تمديد 20:1.

5- محلول إيقاف التفاعل:

يضاف إلى 10 مل من الماء المقطر 2,5 مل من محلول إيقاف التفاعل ثم يمزج جيداً لنحصل على تمديد 5:1 هذه الکمية کافية لطبق إليزا 96 حفرة.

طريقة العمل:

1- يُوضع 50 ميکرولتر من محلول التمديد في جميع حفر طبق الإليزا المغطى بمستضد  فقر الدم المعدي.

2- يُضاف 50 ميکرولتر من عينات المصل المختبر والتي تم تمديدها سابقاً، حيث يتم وضع کل عينة في الحفرة المحددة لها حسب ورقة العمل، ويصبح التمديد النهائي للمصل المختبر 100:1.

3 - يُضاف 50 ميکرولتر من الشاهد الإيجابي في الحفر المخصصة له وهي (A1-A3-H11)، و50 ميکرولتر من الشاهد السلبي في الحفر المخصصة له وهي (A2-H10-H12).

4 - تُحضن لمدة 30 دقيقة بدرجة حرارة الغرفة (22-27م°).

5 - مرحلة الغسيل: يتم التخلص من محتويات الحفر بشکل تام ومن ثم تغسل بمحلول الغسيل بإضافة 300 ميکرولتر لکل حفرة ثم تترک لمدة 3دقائق  في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم التخلص من محلول الغسيل بشکل جيد وتکرر العملية ثلاث مرات.

6 - يُضاف 100 ميکرولتر من محلول الاقتران المرتبط بالأنزيم لجميع الحفر ثم نحضن بدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

7 - تُکرر الخطوة رقم 5.

8- تُضاف الرکيزة حيث يضاف100 ميکرولتر من محلول الرکيزة لکل الحفر، ثم تُحضن بدرجة حرارة الغرفة لمدة 15/دقيقة في مکان مظلم مغطاةً بورق القصدير.

9 - يُضاف 100 ميکرولتر من محلول إيقاف التفاعل مع الانتباه لعدم تشکيل فقاعات هوائية.

10- ضبط جهاز قارئ الإليزا.

11- قراءة طبق الإليزا على موجة طولها 405nm  نانومتر باستخدام جهاز قارئ الإليزا من طراز بيوتک (BioTek (ELX800.

12- وبعد الحصول على القراءة الضوئية (قياس الکثافة البصرية) تحول بواسطة برنامج ProFILE 2.01 for widows المرفق مع مجموعة التشخيص إلى قيم تُعبر عن مستوى الأضداد في مصل الدم وتصنيفها في مجموعات وتوضيحها في مخطط بياني، وان حساب عيار الأضداد يخضع للعلاقة الرياضية التالية:

S/P = (Sample Abs –Average normal control Abs) /

()

Log10 Titre = (1.009x Log10 S/P) + 3.628

Titre = Antilog of Log10 Titre

يؤخذ بعين الاعتبار انه في الشروط الطبيعية للاختبار يجب أن تکون قيمة الکثافة البصرية للشاهد السلبي تتراوح بين 0,075 إلى 0,150، أما في الشاهد الإيجابي فيجب أن تتراوح بين 0,400 إلى 1,00.

ويعتبر اختبار الإليزا لمعايرة الأضداد النوعية لفقر الدم المعدي عند الدجاج صحيحاً ومعتمداً عندما تکون قيمة الکثافة البصرية للشاهد السلبي أقل من 0,200، وعامل التصحيح يتراوح بين 0,250 إلى 0,900.

RESULTS

النتائــج

1- نتائج قياس الأضداد في المجموعة الأولى (صيصان ناتجة من أمَّات غير محصَّنة):

يبين المخطط البياني رقم (1) انحدار مستوى الأضداد النوعية عند صيصان المجموعة الأولى- الناتجة من الأمَّات غير المحصَّنة- خلال أربعة عشر يوم:

المخطط البياني رقم (1)

بلغ متوسط معيار الأضداد الأمية في عمر يوم واحد 2564 وانحدر في عمر سبعة أيام  إلى 1612 اي بنسبة انحدار للأضداد بلغت 38%، أما فيعمر أربعة عشر يوم فقد بلغ معيار الأضداد 901وبلغت نسبة الانحدار في معيار الأضداد عن الجمع السابق 45%، وکانت نسبة انحدار الأضداد خلال أربعة عشر يوم 65%.

يظهر الجدول رقم 1: قيمة معامل الاختلاف والقيمة صفر ومقدار الانحدار الحاصل خلال 14 يوماً في صيصان المجموعة الأولى.

2- نتائج قياس الأضداد في المجموعة الثانية (صيصان ناتجة من أمَّات محصَّنة):

يبين المخطط البياني رقم (2) انحدار مستوى الأضداد النوعية لفيروس فقر الدم المعدي عند صيصان المجموعة الثانية- الناتجة من الأمَّات المحصَّنة - خلال أربعة عشر يوماً.

المخطط البياني رقم (2)

بلغ متوسط معيار الأضداد الأمية في عمر يوم واحد 4582 وانحدر في عمر سبعة أيام  إلى2773 بنسبة انحدار للأضداد بلغت 39,5%، أما في عمر أربعة عشر يوم فقد بلغ معيار الأضداد 1752 وبلغت نسبة الانحدار في معيار الأضداد عن الجمع السابق 37%، وکانت نسبة انحدار الأضداد خلال أربعة عشر يوم 62%.

الجدول رقم 2: يظهر قيمة معامل الاختلاف والقيمة صفر ومقدار الانحدار الحاصل خلال 14 يوماً في صيصان المجموعة الرابعة.

الجدول رقم (1)

DISCUSSION

المناقشة

لوحظ أن قيمة مستوى الأضداد النوعية لمرض فقر الدم المعدي عند الدجاج في عمر يوم واحد في صيصان المجموعة الأولى بلغ 2564 بينما بلغت هذه القيمة 4564 في صيصان المجموعة الثانية، ومن المعروف أن الصيصان التي تملک مستوى أعلى للأضداد تکون محمية بشکل أفضل ضد المرض.

هذا وقد بلغت قيمة معامل الاختلاف CV% في اليوم الأول من عمر صيصان المجموعة الثانية(الناتجة من الأمَّات المحصَّنة) 24,6%، مقابل ضعف هذه القيمة تقريباً في صيصان المجموعة الأولى(الناتجة من قطيع أمات غير محصَّن)، حيث بلغت النسبة 57,5% ، تشير هذه النتيجة إلى الفارق في تجانس المناعة الأمية بين صيصان المجموعة الأولى وصيصان المجموعة الثانية، إنَ هذه النتيجة تعکس أهمية تحصَّين کامل قطيع الأمَّات من أجل أن تنقل هذه الأمَّات لصيصانها مستويات مناعية عالية التجانس عبر کيس المح، حيث کلما نقصت قيمة معامل الاختلاف کلما کان تجانس المناعة أفضل.

أشار الباحث کوشکو وزملاؤه (Khoshkhoo et al., 2011) أن هذه النسبة کانت في الصيصان الناتجة من أمَّات غير محصَّنة ضعف ما هي عليه في الصيصان الناتجة من الأمَّات المحصَّنة حيث کانت 44,7% و 22% على الترتيب.

بلغت نسبة العينات التي أعطت قيمة صفرzero titers في اختبار الإليزا في عمر يوم واحد في صيصان المجموعة الثانية (صيصان ناتجة من أمَّات محصَّنة) 0%، مقابل 14% في صيصان المجموعة الأولى (صيصان ناتجة من أمَّات غير محصَّنة)، نلاحظ أن النسبة کانت کبيرة في صيصان المجموعة الأولى مقابل غياب هذه القيمة في صيصان المجموعة الثانية، إن القيمة صفر zero titers في الصيصان تُشکل حالة حرجة لهذه الصيصان حيث تکون هذه الصيصان عرضة للإصابة بالمرض خاصة في الأسابيع الأولى من عمرها (Yuasa,1994).

أشار الباحث کوشکو وزملاؤه (Khoshkhoo et al., 2011) أن هذه النسبة في الصيصان الناتجة من الأمَّات المحصَّنة بلغت 0%، بينما بلغت في الصيصان الناتجة من أمَّات تعرضت للعدوى الطبيعية 12%.

أما نسبة انخفاض مستوى الأضداد النوعية لفقر الدم المعدي في صيصان المجموعة الثانية (صيصان ناتجة من أمَّات محصَّنة) خلال أربعة عشر يوماً بلغت 62%، مقابل 65% في صيصان المجموعة الأولى (صيصان قادمة من أمَّات غير محصَّنة).

CONCLUSIONS and RECOMMENDATION

الاستنتاجات والتوصيات

يلاحظ من هذه الدراسة أن الصيصان الناتجة من الأمات المحصنة کانت أفضل من الصيصان الناتجة من الأمات غير المحصنة في جميع النقاط التي تم دراستها، حيث لوحظ إن تجانس المناعة فيها کان أفضل بما له من دلالة مهمة على وجود مناعة أفضل في مواجهة التحدي الحقلي للإصابة بالمرض، کما لوحظ عدم وجود القيمة صفر باختبار الاليزا بينما کانت هذه القيمة کبيرة14% في الصيصان القادمة من الأمات غير المحصنة حيث تکون الطيور الخالية من أي مستوى مناعي ضد المرض معرضه للإصابة بالمرض بسهولة.

يستنتج من هذه الدراسة ضرورة الحصول على صيصان قادمة من أمات محصنة ضد مرض فقر الدم المعدي لضمان عدم إصابتها بالمرض والوصول إلى أفضل النتائج المرجوة في تربية دجاج اللحم.

نوصي بتلقيح الأمات لضمان حصول ذريتها على مستويات عالية تؤمن الوقاية والحماية ضد مرض فقر الدم المعدي، کما أننا نوصي بإجراء أبحاث متممة للتعرف على انتشار المرض في القطر العربي السوري والأعمار التي تکون فيها القطعان حساسة للعدوى.

REFERENCES

المراجــع

Chettle, N.J.; R.K.; Eddy, P.J. Wyeth, and S.A. Lister. (1989): An outbreak of disease due to chicken anaemia agent in broiler chickens in England. Vet Rec 124: 211-215.

Engström, B.E. (1999): Prevalence of antibody to chicken anaemia virus (CAV) in Swedish chicken breeding flocks correlated to outbreaks of blue wing disease (BWD) in their progeny. Acta Vet Scand 40: 97-107.

Goryo, M.; Sugimura, H.; Matsumoto, S.; Umemura, T. and Itakura, C. (1985): Isolation of an agent inducing chicken anaemia. Avian Pathol14: 483-496.

Goryo, M.; Suwa, T.; Umemura, T.; Itakura, C. and Yamashiro, S. (1989): Histopathology of chicks inoculated with chicken anaemia agent (MSB1-TK5803 strain). AvianPathol18: 73-89.

Jakowski, R.M.; Fredrickson, T.N.; Chomiak, T.W. and Luginbuhl, R.E. (1970): Hemapoietic destruction in Marek’s disease. Avian Dis 14: 374-38.

Khoshkhoo, P.H. Akbariazad, G. and Tashakori, M. (2011): Comparison of CAV antibody titers in a vaccinated and naturally infected broiler breeder flocks. African Journal of Micro Research Vol. 5(20), pp.          3162-3165.

Mankertz, P. (2008): Molecular Biology of Porcine Circoviruses. Animal Viruses: Molecular Biology. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-22-6. http://www.horizonpress.com/avir

Otaki, Y.; Saito, K.; Tajima, M. and Nomura, Y. (1992): Persistence of maternal antibody to chicken anaemia agent and its effect on the susceptibility of young chickens. AvianPathol21: 147-151.

Pagè-Manté, A.; Saubi, N.; Artigas, C. and Espuña, E. (1997): Experimental evaluation of an inactivated vaccine against chicken anaemia virus. Avian Patho l26: 721-729.

Roussan. D.A. (2006): Serological survey on the prevalence of chicken infectious anemia virus in commercial broiler chicken flocks in Northern Jordan. Int. J. Poult. Sci., 5: 544-546.

Taniguchi, T.; Yuasa, N.; Maeda, M. and Horiuchi, T. (1983): Chronological observations on hemato-pathological changes in chicks inoculated with chicken anemia agent. NatlInstAnim Health Q (Jpn) 23: 1-12.

Yuasa, N. (1983): Propagation and infectivity titration of the Gifu-1 strain of chicken anemia agent in a cell line (MDCCMSB1) derived from Marek’s disease lymphoma. NatlInstAnim Health Q (Jpn) 23: 13-20.

Yuasa, N. (1994): Pathology and pathogenesis of chicken anemia virus infection. ProcIntSymp Infect Bursal Dis Chick Infect Anaemia, Rauischholzhausen, Germany, 385-389.

Yuasa, N. and Imai, K. (1986): Pathogenicity and Antigenicity of eleven isolates of chicken anaemia agent (CAA). AvianPa-thol15: 639-645.

Yuasa, N.; Taniguchi, T. and Yoshida, I. (1979): Isolation and some characteristics of an agent inducing anemia in chicks. Avian Dis 23: 366-385.

Yuasa, N.; Noguchi, T.; Furuta, K. and Yoshida, I. (1980): Maternal antibody and its effect on the susceptibility of chicks to chicken anemia agent. Avian Dis 24: 197-201.

Yuasa, N.; Taniguchi, T.; Goda, M.; Shibatani, M. Imada, T. and Hihara, H. (1983a): Isolation of chicken anemia agent with MDCC-MSB1 cells from chickens in the field. NatlInst Anim Health Q (Jpn) 23:75—77.

Yuasa, N.; Taniguchi, T.; Imada, T. and Hihara, H. (1983b): Distribution of chicken anemia agent (CAA) and detection of neutralizing antibody in chicks experimentally inoculated with CAA. NatlInst Anim Health Q (Jpn) 23: 78-81.