DETERMINATION THE BIOLOGICAL EFFECTIVENESS PYOCYANIN DYE PRODUCED FROM BACTERIA PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Assiut University web-site: www.aun.edu.eg

DETERMINATION THE BIOLOGICAL EFFECTIVENESS PYOCYANIN DYE PRODUCED FROM BACTERIA PSEUDOMONAS AERUGINOSA

BUTHINA ABDULHAMEED ABDULLAHA

Assistant Professor of Pharmacology, Department of Physiology and Pharmacology

Received: 31 March 2016;           Accepted: 30April 2016

تحديد الفعالية البيولوجية صبغة Pyocyanin المنتجة من بکتريا  Pseudomonas aeruginosa

بثينة عبد الحميد عبد اللة

(فرع الادوية والفسلجة) جامعة تکريت - کلية الطب البيطري

E-mail: buthinaabad67@yahoo.com     Assiut University web-site: www.aun.edu.eg

اجري العمل بالبحث للفترة من بداية شهر تشرين الثاني الى نهاية شهر کانون الأول لعام 2013 إذ تم الحصول على العينة  من کلية العلوم جامعة تکريت وقد تم تأکيد العينة باستخدام الفحوصات البيوکيمياوية.

کما تم أيضا استخلاص DNA لبکتريا P.aeruginosa لمعرفة الجين المسؤول عن انتاج pyocyanin واجراء الترحيل الکهربائي الذي أدى الى ظهور حزم للبادئات المخصصة التي تشير الى وجود الجينات المخصصة عن pyocyanin في کروموسوم P.aeruginosa.

وقد أظهرت النتائج أن العزلة قد أنتجت أعلى کمية  من ال pyocyanin والتي  تبلغ (23.41µg/ml).

کما تم دراسة تأثير ال pyocyanin على نمو بعض أنواع البکتريا وأظهرت النتائج أن للبايوسيانين تأثير فعال على تثبيط نمو أنواع بکتيرية منها Escherichia coli, E.faecalis Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, وأيضاً کان له تأثير على بکترياP.aeruginosa .

المقدمـة

INTRODUCTION

تــعد بــکتريا Pseudomonas aeruginosa مــن المسـببــات المــرضية الانتـهـازيـة  (Opportunistic Pathogens)التي نادرا ما تسبب المرض في الأشخاص الأصحاء , ولکنها تشکل خطرا حقيقيا للمرضى الراقدين في المستشفيات ,إذ تعد أهم الأنواع البکتيرية المسببة لما يعرف بالإصابة المکتسبة في المستشفيات (Nosocomial infection) إذ تتمکن من أن تتواجد على أرضية ردهات المستشفيات وصالات العمليات ، والأدوات الجراحية وغيرها , کما تمتلک القدرة على البقاء في المواد المطهرة وبعض أنواع المعقمات (Greenwood et al., 2007).

Corresponding author: BUTHINA ABDULLAHA

E-mail address: buthinaabad67@yahoo.com

Present address: Assistant Professor of Pharmacology, Department of Physiology and Pharmacology

توصف بکتريا  P.aeruginosa بأنها متعددة البراعات Versatility)) إذ يمکنها استخدام أنواع مختلفة من المواد الأولية  کمغذيات وذلک لامتلاکها أنزيمات متعددة ومتنوعة تمکنها من إنجاز عمليات أيضية مختلفة في أعضاء مختلفة في الجسم إذ تتمکن من إصابة ذوي المناعة المثبطة, وإصابات المستشفيات والجروح والحروق ومرضى زراعة الأعضاء وغيرها, کما تعرف بأن لها قدرة على التکيف للظروف غير الطبيعية ومنها.

امتلاکها مستوى عالياً من المقاومة لمعظم أنواع المضادات الحيوية(Balch and Smith, 1994; Lyczak et al., 2000 and Doring, 1993)

تتصف بکتريا P.aeruginosa بأنها من الميکروبات الشائعة والواسعة الانتشار Ubiquitous)) إذ توجد في الترب والمياه وکفلورا جلدية وفي معظم البيئات الصناعية , ولهذا فهي تستعمر العديد من البيئات الطبيعية والصناعية , إذ يمکن الکشف عنها في البيئات غير الحية مثل خزانات المياه الملوثة بفضلات الإنسان أو الحيوان وفي فضلات مياه المستشفيات ولأنها تفضل البيئات الرطبة فهي لذلک توجد ملوثة للأجهزة الطبية ومن ضمنها القاطرCatheters مسببة إصابات مختلفة عند استخدامها(Willey et al.,2008; Lyczak et al., 2000)

تتمکن سلالات P.aeruginosa من إنتاج أنواع من الصبغات وهي صبغة البايوسيانين Pyocyanin التي تتصف بأنها صبغة زرقاء مخضرة تذوب في الماء والکلوروفورم ، وصبغة الفلورسين Fluorescen الأصفر المخضر التي تذوب في الماء ولاتذوب في الکلوروفورم، وصبغة البايوروبين Pyorubin التي يکون لونها أحمر داکناً, والبايوميلانينPyomelanin  ذات اللون الأسود (Todar, 2004). إن أهم أنواع الصبغات المنتجة هي البايوسيانين (Hassan, H.M. and Fridovich, I 1980) أن للبايوسيانين فعالية مضادة لأنواع بکتيرية وفطرية مختلفة Antibacterial)) وهو قاتل لأنواع عديدة من البکتريا bacteriocidal)) منها :-

Escherichia coli,Staphylococcusaureus تلاحظ فعاليته القاتلة على أطباق الأکار کمنطقة شفافة حول مستعمرة البکتريا المقاومة وهذه الفعالية تسمح للبکتريا المنتجة له بالتنافس مع البکتريا الأخرى التي تشغل نفس المکان. إضافة لذلک فإن للبايوسيانين تأثيراً علاجياً متنوعاً على خلايا حقيقية وبدائية النواة ، إضافة لذلک فإن للبايوسيانين تأثيراً علاجياً متنوعاً على خلايا حقيقية وبدائية النواة (Saha et al., 2008).

المواد وطرائق العمل

MATERIALS AND METHODS

المواد Materials:                       

الأدوات والأجهزة المختبرية Equipments and apparatus:

جدول رقم (1-2) الأدوات والأجهزة المختبرية المستخدمة في البحث.

المواد الکيمياوية والبايولوجية Chemicals  and biological materials

المواد  الکيمياوية :جدول (3-2)المواد الکيمياوية المستخدمة في الدراسة

الأوساط الزرعية الجاهزة :

حضرت الأوساط الزرعية المذکورة أدناه بحسب تعليمات الشرکة المصنعة لها والمثبتة على العبوات الخاصة بکل منها.

جدول (3-3) الأوساط الزرعية والغرض من استخدام کل الوسط.

المضادات الحيويةAntibiotic discs

جدول 4-3)): المضادات الحيوية المستخدمة في اختبار حساسية عزلات بکتريا P.aeruginosa

العزلات البکتيرية

جدول (5-3) العزلات البکتيرية المستخدمة في البحث ومصادرها.

طرائق العمل:

الأوساط الزرعية المحضرة:-

تم تحضير الاوساط الزرعية حسب تعليمات الشرکة المنتجة وتم تعديل الرقم الهيدروجيني باستخدام (0.1 N) NaOH أو (0.1 N) HCl .

وسط أجار الدم الصلب Blood Base Agar

بعد تحضير وزن معين من وسط أجار الدم الصلب حسب تعليمات الشرکة المصنعة وتعقيمه بدرجة حرارة121^ە م وضغط 15 باوند /أنج لمدة 15 دقيقة , ترک ليبرد بدرجة حرارة50 ^ە م وأضيف إليه الدم البشري المعقم بنسبة 10% ووزع على أطباق بتري معقمه.

وسط اختبار الحرکة Motility test medium

استخدم للتحري عن قابلية البکتريا على الحرکة ,حضر بإضافة%0.5  من الاجار- أجار إلى الوسط المغذي السائل ,عقم بالموصدة ((Autoclave , ووزع على أنابيب اختبار ثم لقح بالحقن (Cruickshank et al ., 1975 and Collee et al.,1996).

وسط اليوريا الصلبurea media

بعد تحضيره حسب تعليمات الشرکة المصنعة وتعقيمه بالموصدة ((Autoclave ترک ليبرد وأضيف إليه(%20)  يوريا معقمة بالترشيح , صب في أنابيب معقمة بشکل مائل وحفظ بدرجة 4^ەم لحين الاستخدام  (Collee et al ., 1996).

وسط ماکونکي أجار MacConkey agar

بيبتون - 17 g بروتيوز بيبتون - 3 g لاکتوز - 10 g  املاح الصفراء - 1.5 g کلوريد الصوديوم - 5 g الأحمر المحايد - 0.03 g  اجار - 13.5 g ماء - يضاف ليصل المجموع 1 لتر ,ويعدل اس هيدروجينيإلى  7 ويعقم فى الاتوکلاف ثم يوزع فى أطباق بترى معقمة.

وسط Pseudomonas broth (PB)

حضر من أذابة 20 غم ببتون peptone و1.4غم کلوريد المغنيسيوم MgCl₂ و10غم کبريتات البوتاسيوم K2SO₄ في لتر من الماء المعقم ماء وضبط الاس الهايدروجيني عند 7.4-7.2 باستخدام (1N) NaOH.(Essar et al., 1990)

وسط اختبار الأندول Indol test

استخدم الوسط للتحري عن أيض التربتوفان في البکتريا ,حضر من إذابة 20 غم من الببتون و5 غم NaCl في لتر من الماء المقطر وعدل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 قبل التعقيم بالموصدة (Cruickshank el al., 1975 and Collee et al., 1996)

الکواشف والمحاليل :-

کاشف کتاليز Catalase

استخدم للتحري عن إنتاج البکتريا لأنزيم Catalase, وقد حضر بترکيز3 % (Collee et al., 1996)

کاشف الاوکسيديزOxidase

استخدم للتحري عن قابلية البکتريا عن إنتاج أنزيم Oxidase , وقد حضر بترکيز %1 بعد أن تم إذابة 0.1 غم من کاشف (Tetramethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride) في 10مللتر من الماء المقطر وحفظ في قنينة معتمة, واستعمل آنيا (Collee et al., 1996).

کاشف کوفاک Kovac

حضر بإذابة 5 غم من  P-dimethyl aminobenzaldehyde في 75مللتر کحول أيزوأميلي ثم أکمل الحجم الى 100مل باستخدام حامض الهيدروکلوريک المرکز ببطء ليصبح لون الکاشف أصفر شاحباً وحفظ في الثلاجة لحين الاستخدام

(Cruickshank et al., 1975 and Collee et al., 1996).

کاشف المثيل الأحمر Methyl Red (MR)

حضر بإذابة 0.1 غم من المثيل الأحمر في  300مل کحول أثيلي 95%)) ثم أکمل الحجم إلى 5.0مل باستخدام  ماء مقطر

Cruicshank et al., 1975 and Collee et al., 1996))

محلول کاشف Voges-Proskauer (VP)

يتکون من محلولين:

أ- کاشف ألفا-نافثول 5% :حضر بأذابة 5غم من ألفا-نفثول وأکمل الحجم إلى 100مل باستخدام کحول أثيلي (%99).

ب- کاشف هيدروکسيد البوتاسيوم 40% : حضر بإذابة 40 غم من KOH في 100مل من الماء المقطر

(Cruickshank et al., 1975 and Collee et al., 1996)

التعقيم Sterilization

التعقيم الرطب (Autoclaving) wet sterilization :

عقمت الأوساط الزرعية باستخدام التعقيم الرطب واستعملت فيه الموصدة (Autoclave) بدرجة حرارة121^ەم وضغط 15 باوند/أنج² ولمدة 20-15 دقيقة عدا الأوساط التي احتاجت إلى طرق تعقيم أخرى والتي ذکرت في فقرة تحضيرها (Cruickshank et al., 1975) .

حفظ السلالات البکتيرية وإدامتها :

حفظت العزلات البکتيرية بعد تشخيصها على أوساط زرعيه مائلة Slants من الأجار المغذي Nutrient agar  في الثلاجة بدرجة 4^ەم واستمرت عملية الإدامة بشکل دوري شهرياً من خلال تجديد زرعها على أوساط جديدة لضمان بقائها نشطة طيلة مدة الدراسة, وهذا الحفظ يعد قصير الأمد. أمکن إدامة العزلات البکتيرية مزروعة على أطباق حاوية على Nutrient Agar وحفظت في الثلاجة بدرجة 4^ەم لعدة أسابيع.

الحصول على العينات  Obtain samples

تم الحصول على العينات من کلية العلوم جامعة تکريت وکانت معزولة بشکل تام.

زرع العينات

تم زرع العينات على وسط MacConkey agar وحُضِنَتْ في درجة 37^ە م لمدة 24 ساعة ثم نقلت المستعمرات المفردة غير المخمرة لسکر اللاکتوز التي تبدو شاحبة  paleعلى الوسط.

التشخيص Identification :

تم تشخيص العزلات النامية باستخدام الاختبارات المظهرية والمجهرية والکيموحيوية وفق ماورد فيCruickshank  وآخرون (1975) , Collee وآخرون (1996) ,

اختبار Catalase

تم إجراء الاختبار بأخذ مستعمرة مفردة باستخدام الناقل (Loop) ومزجت مع بضع قطرات من کاشف H₂O₂ بترکيز 3 %  ولوحظت النتيجة الموجبة بظهور فقاعات على الشريحة الزجاجية.

1993).(Cowan and Steel’s

اختبار Oxidase

تم إجراء الاختبار بوضع بضع قطرات من کاشف Oxidase على ورقة ترشيح ثم نقلت مستعمرة مفردة باستخدام عود خشبي ووضعت على موضــع القطــرة. إن ظهـــور اللــون الأزرق الارجواني بعد 10-5 ثــوانٍ دلالــة على إيجابيــة الاختبار. 1993) (Cowan, and Steel’s

اختبارات IMViC

A– اختبار الأندول Indol test

لقح ماء الببتون بمزروع العزلة المراد اختبارها ثم حضنت عند درجة حرارة 37^ە م لمدة 24-48 ساعة وأضيفت  0.5مللتر من کاشف Kovac ,عُدّت نتيجة الاختبار موجبة عند ظهور حلقة حمراء على سطح الوسط .  1993).(Cowan and Steel’s.

B- اختبار المثيل الأحمر Methyl red test

لقح ماء الببتون بمزروع العزلات البکتيرية وحضن بدرجة حرارة 37^ەم لمدة 24 -48 ساعة , ثم أضيف إليه خمس قطرات من کاشف المثيل الأحمر, إنَّ تحول الوسط إلى اللون الأحمر دلالة على النتيجة الموجبة . 1993).(Cowan and Steel’s

C– اختبارVoges Proskauer test

لقح ماء الببتون بمزروع العزلات البکتيرية وحضن بدرجة حرارة37 ^ەم لمدة 24 ساعة , ثم أضيف 1مل من کاشف هيدروکسيد الصوديوم و 3 مللتر من کاشف إلفا-نافثول (%5) , عدت النتيجة موجبة بظهور اللون الأحمر بعد5 دقائق .1993).(Cowan and Steel’s

D- اختبار استهلاک السترات Cirate Utilization test

لقح وسط أکار سيمون السترات الحاوي على مادة بروموثايمول الزرقاء Bromothymol blue  بمستعمره فتية وحضن عند 37^ەم لمدة 24 ساعة. عُدّت النتيجة موجبة من خلال تغير لون الوسط من الأخضر إلى الأزرق. 1993).(Cowan and Steel’s

اختبار الحرکةMotility test

لقح وسط الحرکة شبه الصلب Semi-Solid media بالطعن Stabbling وحضن بدرجة حرارة 37^ەم لمدة 24 ساعة. إن ظهور منطقة ضبابية حول خط الطعن دليلٌ على النتيجة الموجبة. (Cowan and Steel’s 1993)

اختبار إنتاج اليوريزUrease test

لقح وسط اليوريا الصلب بالتخطيط وحضن بدرجة حرارة 37^ەم لمدة 24-48 ساعة , لوحظت النتيجة الموجبة بتحول لون الوسط الى الوردي .(Cowan and Steel’s1993)

اختبار حساسية البکتريا للمضادات الحيوية:

*حُضَّرَ وسط مولر هنتون الصلب وصب في أطباق معقمة بحيث لا يقل ارتفاع الوسط عن 4 ملمتر وتُرک  ليتصلب.

*حضر اللقاح البکتيري بأخذ عدة مستعمرات من مزرعة حديثة بوساطة الناقلLoop  ونقلت الى أنبوبة اختبار تحتوي على 5 مللتر من الوسط المغذي السائل بحيث تکون عکارتها مساوية لعکارة المحلول القياسي ماکفرلاند الذي استعمل للمقارنة لإعطاء عدد تقريبي للخلايا الجرثومية والذي يبلغ حوالي1.5x 10⁸ خلية/ مليلتر

*نشرo.1 من محلول البکتريا على سطح الوسط الزرعي بواسطة المسحة القطنية المعقمة (Steril swab).

*ترکت الأطباق لمدة 5-3 دقائق لتجف .

*نقلت أقراص المضادات الحيوية المذکورة في الجدول رقم (4-3) باستخدام ملقط معقم ووزعت على الأطباق المزروعة بالبکتريا بواقع 5 أقراص/طبق.

*حضنت بدرجة حرارة 37^ەم لمدة 16-18 ساعة.

Clinical and Laboratory Standards Institute [M7-A7], 2006).

إنتاج واستخلاص وتنقية البايوسيانين:-

إنتاج صبغة البايوسيانين

زُرِعَتْ العزلات المختارة والتي أعطت أغمق لون للصبغة على وسطPseudomonas broth (pB)  المشجع لإنتاج صبغة البايوسيانين بدرجة حرارة 37^ە م ولمدة 48 ساعة إذ تم ملاحظة تغير لون الوسط من اللون الأبيض إلى اللون الأخضر المزرق , بعدها عرضت أنابيب الاختبار التي تم زرع البکتريا فيها إلى مصدر ضوئي وبدرجة حرارة الغرفة ولمدة 24 ساعة إذ تعمل على تشجيع البکتريا على زيادة إنتاج الصبغة لتحول الوسط إلى اللون الأزرق الداکن, أجريت التجربة کما ورد في Essar وآخرون عام (1990).

استخلاص البايوسيانين

استخلص البايوسيانين من راشح المزارع الجرثومية وتم تقدير فعاليته اعتماداً على ما جاء في Essar وآخرون عام (1990) إذ رسبت المزرعة النامية في  5 مل من وسط PB باستخدام جهاز الطرد المرکزي عند سرعة 3000 rpm لمدة 10 دقائق ثم نقل الراشح إلى أنبوبة أخرى وأضيف إليه3 مل من الکلوروفورم ومزج جيداً ثم أزيلت الطبقة العليا وأضيف لها1 مل من حامض HCl ذي عياريه 1N)) لحين تحول اللون الوردي إلى الأحمر الغامق , فصل المحلول بعد وضع الأنبوب في جهاز الطرد المرکزي عند سرعة  3000 rpm  لمدة 5 دقائق ثم نقلت الطبقة العليا إلى Cuvette tube وقيست امتصاصية المحلول عند  520 nmباستخدام جهاز المطياف الضوئي Spectrophotometer .ثم تم حساب الترکيز والذي يعبر عن کل مايکروغرام من البايوسيانين المنتج/مليلتر من راشح المزارع وذلک بضرب الکثافة البصرية عند nm520 OD₅₂₀)) في 17.072. کما مبين في الشکل (1-3) الذي يوضح خطوات أستخلاص وتنقية البايوسيانين.

تنقية البايوسيانين Purification of pyocyanin

تم تنقية البايوسيانين المستخلص والمقاس کميا في الفقرة السابقة اعتماداً على ماجاء في Saha وآخرون عام (2008). تم تنمية عزلة واحدة من عزلات الأذن الوسطى والجروح والحروق والقشع  والإدرار المنتجة لصبغة البايوسيانين کلاًّ على حدة  في دوارق  تحتوي على وسط PB)) بمقدار 300 مل لکل دورق للحصول على کمية أکبر من البايوسيانين وحضنت بدرجة حرارة 37^ە م ولمدة 48 ساعة, کررت نفس خطوات الاستخلاص مع حذف خطوة قياس الامتصاصية وإضافة منظم borate-NaOH(0.4M) ذي الرقم الهيدروجيني 10إلى البايوسيانين المستخلص إلى أنتغير اللون إلى الأزرق , کررت هذه الخطوات لعدة مرات لحين الحصول على محلول أزرق صافٍ من البايوسيانين مذابا في الکلوروفورم.

ولإنتاج أکبر کمية من صبغة البايوسيانين زرعت هذه العزلات على وسط Pseudomonas broth (PB) الذي يحوي في ترکيبه على العناصر وتراکيزها المشجعة على إنتاج صبغة البايوسيانين ولإنتاج أکبر کمية قمنا بتنمية عزلة واحدة من کل من المصادر المختلفة کلاً على حدة في دوارق ذات حجم 500 مليلتر وبمقدار 300 مليلتر من وسط PB)) وقد حضنت الأطباق بدرجة حرارة 37^ەم وهي الدرجة المثلى لإنتاج أکبر کمية من البايوسيانين من العزلات المرضية لبکتريا P.aeruginosa لمدة 48 ساعة, ثم تم  تنقيته وبعد تبخير الکلوروفورم جمع البايوسيانين من مصادر الإصابات الخمسة المذکورة سابقاً کلاًّ على حدة في حاويات معقمة ونظيفة وحفظ بدرجة -20 ^ەم لحين الاستخدام, الشکل (1-3) .

تقدير نسبة الرطوبة في مسحوق البايوسيانين

قدرت نسبة الرطوبة في مسحوق البايوسيانين اعتماداً على ماجاء في  AOACعام (2002) , إذ وضعت کمية من البايوسيانين في فرن حراري عند 105^ەم لحين ثبات وزن العينة وقدرت نسبة الرطوبة من خلال الفرق بين وزن العينة قبل التجفيف وبعده.

تقييم فعالية البايوسيانين کمضاد مايکروبي مختبرياً

تم تقييم فعالية البايوسيانين المعزول والمنقى من من بکتريا P.aeruginosa تجاه أنواع من البکتريا السالبة لصبغة جرام ـP.aeruginosa, E. coli ,S.typhi والموجبة لصبغة جرام من الأنواع S.aureus, E. faecalis .

تم إعداد معلق بکتيري من أنواع البکتريا وتم مقارنة محاليل المعلق مع محلول ماکفرلاند القياسي (0.5) لتثبيت الأعداد عند 1.5x 10⁸خلية / مليلتر, ثم نقل 0.1 مل من کل من العوالق إلى سطح الوسط الزرعي مولر هنتون الصلب وتم نشرها على السطح وترکت لمدة 30 دقيقة ثم نقل 100 مايکروليتر من البايوسيانين بترکيز (%0.2) إلى حفر معدة على نفس الوسط ثم حضنت عند 37^ەم لمدة 24 ساعة وبعدها أخذ قياس قطر منطقة التثبيط لکل نوع.

استخلاص DNA من بکتريا P.aeruginosa

• عمل طرد مرکزي مالا يزيد عن 3 ملليتر من serum بقوة ( 4000xg ) لمدة 10 دقائق بدرجة حرارة الغرفة
• سحب الطبقة العليا واهمالها .
• اضافة 100 مايکرو ليتر من محلول الاذابة (TE buffer) ثم نمرر النماذج على جهاز الدوام لإکمال المزج واذابه الاجسام الصلبة .
• إضافة 10 مايکرو ليتر من (lysozyme ) .
• حضن بدرجه 37 لمده 10 دقائق   .
• اضافه 100 مايکرو ليتر من (BTL Buffer) و 20 مايکرو ليتر من (proteinase k) ثم مزج بجهاز الدوام (Vortex)
• حضن بدرجة حرارة 55 لمدة ساعة مع التحريک کل 20 دقيقة
• طرد المرکزي بقوة  10000 xg)) لدقيقتين لإتمام هضم المواد غير المهضومة .
• سحب الطبقة العليا ووضعها في انبوب جديد سعة 1.5ml بدون التماس مع الطبقة السفلى
• أضافة 220 مايکرو لتر من محلول BDL ثم مزج بجهاز الدوام (Vortex)
• حضن بدرجه حرارة  65 لمدة 10 دقائق
• اضافة 220 مايکرو ليتر من الايثانول (96_100%) ثم مزج بالدوار لمدة 20 ثانيه بأعلى سرعه لإتمام المزج واذا ظهرت فقاعات يتم سحبها بالماصة الدقيقة
• وضع (Hi Bind DNA mini column) (انابيب خاصة بالطقم الجاهز والتي تحتوي على مرشح filter) في انابيب سعه 2 ml  (collection tube)
• نقل النماذج من انبوب 1.5 ml الى الانابيب الخاصة بالطقم
• طرد مرکزي بقوة 10000 xg)) لمدة دقيقة واحدة
• اهمال الانبوب 2 ml  والراشح الذي ترشح عبر الفلتر من الانبوب الخاص
• وضع الانبوب الخاص في انبوب 2 ml جديد
• اضافه 500 مايکرو ليتر من HB Buffer
• طرد المرکزي بقوه 10000 xg)) لمده دقيقه واحده
• اهمال الراشح عبر المرشح مع الاحتفاظ بالأنبوب 2 ml
• اضافه 700 مايکرو ليتر من محلول الغسل ثم طرد مرکزي بقوة 10000 xg)) لمدة دقيقة واحدة
• اهمال الراشح عبر المرشح مع الاحتفاظ بالأنبوب 2 ml
• اعاده الخطوات الخاصة بالغسل اي اعاده الغسل
• وضع الانابيب الفارغة الخاصة بالDNA بجهاز الطرد المرکزي بسرعه 10000 xg)) لمدة 2 دقيقه لتجفيف الانابيب
• وضع الانابيب في انابيب سعه 1.5 مل جديده
• أضافه 100-50 مايکرو ليتر من (Elution buffer) المسخن مسبقاً بدرجة حرارة 65
• حضن لمدة 5 دقائق بدرجة حرارة الغرفة (25°)
• طرد مرکزي بقوة 10000 xg )) لمدة دقيقة واحدة
• اعادة عمليه ( Elute ) مرة أخرى
• حفظ Eluted DNA بدرجه حراره -20

 تقدير ترکيز DNA المستخلص ونقاوته:

تم تقدير ترکيز الـDNA عن طريق وضع 1 مايکرو ليتر من العينة المستخلصة في جهاز (Nano drop) وتراوحت نقاوة العينة من 1.82-1.6 .

تخفيف البرايمرات

تم تخفيف البرايمرات حسب مواصفات الشرکة المصنعة والمجهزة من شرکة (Bioneer) .

البادئات المخصصة specific Primers

جهاز PCR (Polymerase chain reaction)

تم نبذ المزيج في جهاز Microcenterfuge لفترة (7) ثانية لإتمام مزج مکونات التفاعل ، مع مراعاة أن يکون العمل داخل Hood معقم وارتداء القفازات ووضع الأنابيب داخل عبوة ثلج ثم تطبيق البرنامج الآتي:

دورة واحدة لمدة 5 دقائق على درجة حرارة (94)^O للمسخ الأولي لشريط DNA ثم تليها (30) دورة تضاعف تتضمن کل دورة 30 ثانية بدرجة حرارة 94))^O لمسخ الشريط المزدوج و 30 ثانية بدرجة حرارة (60)^O لارتباط البادئ DNA القالب 30 ثانية بدرجة حرارة (72)^O لاستطالة البادئ  ثم بعد ذلک دورة أخيرة لمدة 10 دقائق وعلى درجة حرارة (72)^O لاستکمال مرحلة الاستطالة .

النتائج والمناقشة

RESULTS AND DISCUSSION

عزل وتشخيص P.aeruginosa Isolation and Identification of

أجريت الاختبارات التشخيصية الزرعية والکيموحيوية بالاعتماد على Baron و Finegold عام(1990)  , Holt وآخرون عام(1994)  , Collee وآخرون عام (1996) , Prescott وآخرون عام (2005) , وWilley  وآخرون عام (2008)  لغرض عزل وتشخيص جرثومة P.aeruginosa وقد أثبتت العزلة قدرتها على النمو على وسط ماکونکي الصلب وهو وسط اختياري تفريقي لاحتوائه على أملاح الصفراء (Bile salts) وصبغة البنفسجي البلوري (Crystal violet) المثبطة لمعظم البکتريا الموجبة لصبغة جرام , وتفريقي لأنه يميز بين البکتريا المخمرة وغير المخمرة لسکر اللاکتوز لذلک کان ظهور مستعمرات بکتريا P.aeruginosa على الوسط شاحباً (Pale) لأنها غير مخمرة لسکر اللاکتوز.

ولدراسة الصفات المظهرية للمستعمرات , زرعت مستعمرة مفردة نقية من کل عزلة على الوسط المغذي الصلب , فظهرت المستعمرات ذات تحدب قليل وحافات مسطحة, وأظهرت العزلة قدرتها على إفراز صبغة البايوسيانين الخضراء المزرقة عند النمو , وکان لجميع العزلة رائحة مميزة تشبه  رائحة العنب grape-like لوجود مادة aminoacetophenone.

وقد تم اختيار مستعمرة مفردة لکل عزلة وزرعت على وسط الدم الصلب , وهو وسط غذائي تنشيطي لتحديد قابلية البکتريا على تحلل الدم ونوع التحلل , وکانت العزلة محللة للدم تحللاً کاملاً إذ ظهرت هالة شفافة حول المستعمرة .وعند إجراء الفحص المجهري للمسحة البکتيرية المصبوغة بصبغة جرام, ظهرت بکتريا P.aeruginosa سالبة لهذه الصبغة وعلى شکل عصيات مفردة أو سلاسل قصيرة.

وقد أظهر التشخيص أن العزلة أعطت نتيجة موجبة لاختبار إنتاج الأوکسيديزOxidase  وهو من الاختبارات التشخيصية المهمة

کما أظهرت فحصاً موجباً لاختبار الکتاليز Catalase. کما وأجرية فحص IMViC وکانت النتيجة سالبة اختبار الأندول Indole

وعند إضافة الکاشف کانت النتيجة سالبة لاختبار فوکس بروسکور , وهو اختبار يستخدم للتحري عن قابلية البکتريا للتخمر الجزئي لسکر الکلوکوز, إن العزلة کانت سالبة لهذا الاختبار.

وأظهرت جميع العزلات نتيجة موجبة عند تنميتها على وسط (citrate (Simmon الذي يستخدم للتحري عن قابلية البکتريا لاستهلاک السترات کمصدر وحيد للکاربون, وذلک بتحول لون الوسط إلى الأزرق وکما أوضحت نتيجة لأنزيم اليوريز ان النتيجة کانت الموجبة تحول لون الوسط من اللون الأصفر إلى الوردي .

-3 إنتاج واستخلاص وتنقية البايوسيانين

کانت العزلة مفرزة للصبغة بشکل وفير للبايوسيانين , إذ يتباين إنتاج الصبغة من سلالة إلى أخرى ومن ثم تم استخلاص البايوسيانين بالکلوروفورم بالاعتماد على الطريقة الموصوفة من قبل Essar وآخرون عام (1990) لأنه يذيب البايوسيانين فقط على عکس الماء الذي يذيب البايوسيانين والفلورسين معاً واللذين يختلفان في ترکيبهما الکيميائي وبهذه الطريقة تم تحديد کمية البايوسيانين المنتجة باستخدام جهاز المطياف الضوئي , ولإنتاج أکبر کمية من صبغة البايوسيانين  زرعت هذه العزلات على وسط Pseudomonas broth (PB) الذي يحوي في ترکيبه على العناصر وتراکيزها المشجعة على إنتاج صبغة البايوسيانين وبعد تبخير الکلوروفورم باستخدام الحاضنة وعلى درجة 40^ەم  لمدة 48 ساعة وتم حفظ مسحوق البايوسين في حاويات نظيفة ومعقمة في درجة حرارة -20^ەم لحين استخدامه.

حساسية العزلة للمضادات الحيوية :-

استخدم اختبار انتشار الأقراص القياسي لتحديد حساسية بکتريا P.aeruginosa تجاه أنواع متعددة من المضادات الحيوية وقورنت أقطار التثبيط مع القيم القياسية لتحديد درجة أو حالة مقاومة العزلة اعتماداً على NCCL عام .(2002) تضمنت المضادات الحيوية الأنواع الآتية:-Amoxicillin-Clavulanicacid (AMC), Cefotaxime (CTX), Ciprofloxacin (CIP), Chloramphenicol (C) Neomycin (N) ,

بينت النتائج کما في الصورة 2-4)) أن عزلة البکتريا کانت حساسة لمضاد Ciprofloxacin .

وأثبتت النتائج الحالية أن أکفأ المضادات في علاج الإصابات بالــ P.aeruginosa هو مضاد Ciprofloxacin وهو من مجموعة الفلوروکوينولون، وإن تطور المقاومة للمضادات تُعَدّ مشکلة علاجية کبيرة يمکن أن توضح بالرجوع إلى بعض الفرضيات منها الاستخدام المفرط أو استخدام المضاد الحيوي غير الملائم (Sotto et al., 2001).

صورة (1-3): حساسية بکتريا P.aeruginosa

اللون الأحمر الحساسية للمضاد / اللون الأسود المقاومة للمضاد.

التقدير الکمي للبايوسيانين المستخلص من P.aeruginosa:-

قدرت کمية البايوسيانين المستخلص بالاعتماد على تقدير الامتصاصية باستخدام جهاز المطياف الضوئي Spectrophotometer عند طول موجي 520nm. الصورة  (3-4) توضح خطوات استخلاص وتنقية البايوسيانين.

 إن کمية الانتاج کانت من بکتريا P.aeruginosa المعزولة کانت بمقدار ((23.41µg/ ml وإن الاختلاف في کمية البايوسيانين المنتجة قد يعود إلى حالة تنظيم الإفراز المعتمد على تجمع الخلايا البکتيرية .

الترکيز المثبط الأدنى  (MIC)للبايوسيانين على أنواع بکتيرية مرضية:

أظهرت النتائج إن الترکيز المثبط الأدنى للبايوسيانين المنقى تجاه أنواع بکتيرية شملت E.coli,S.aureus, S.typhi,  P.aeruginosa ,E.faecalis کان0.005 غم/ مل وعلى جميع الأنواع البکتيرية.

فعالية البايوسيانين في التثبيط المايکروبي :

بعد أن تم تحديد الترکيز المثبط الأدنى (MIC) للبايوسيانين ضد الأنواع المايکروبية المختلفة والذي کان عند0.005 غم/مل فقد تم تقييم فعاليته التثبيطية ضد أنواع بکتيرية موجبة وسالبة لصبغة جرام.

ومن ثم تم رفع ترکيز البايوسيانين لملاحظة التثبيط بصورة أوضح على أطباق الأکار إذ أظهرت النتائج أن الترکيز( ( 0.2 غم /مل من البايوسيانين

جدول1-3 : الفعالية التثبيطية للبايوسيانين المنقى من P.aeruginosa مقدرةً بالملم

أقطار التثبيط ضد النوع P.aeruginosa فکانت (25) ملم .

صورة (3-3) الفعالية التثبيطية للبايوسيانين بترکيز %0.2)) المستخلص من بکتريا P.aeruginosa على بکتريا P.aeruginosa .بعد24  ساعة من التحضين على وسط  (Muller Hinton agar).

وعلى النوع S.aureus کانت (19) ملم کما في الصورة .

صورة (4-3) الفعالية التثبيطية للبايوسيانين بترکيز %0.2)) المستخلص من بکتريا P.aeruginosa على بکتريا S.aureus بعد24  ساعة من التحضين على وسط (Muller Hinton agar)

والنوع  E.faecalis(23 ) کما في الصورة .

صورة (5-3) الفعالية التثبيطية للبايوسيانين بترکيز %0.2)) المستخلص من بکترياP.aeruginosaعلى بکتريا E.faecalis . بعد24  ساعة من التحضين على وسط (Muller Hinton agar).

والنوع S.typhi کانت (22  ) ملم کما في الصورة .

صورة (6-3) الفعالية التثبيطية للبايوسيانين بترکيز %0.2)) المستخلص من بکتريا P.aeruginosa على بکتريا S.typhi بعد24  ساعة من التحضين على وسط (Muller Hinton agar).

وبکتريا E.coli بأقطار تثبيطية(21)  ملم.

صورة (7-3) الفعالية التثبيطية للبايوسيانين بترکيز %0.2)) المستخلص من بکترياP.aeruginosa على بکتريا E.coli بعد24  ساعة من التحضين على وسط (Muller Hinton agar).

وقد أظهرت النتائج ان اعلى فعالية تثبيطية للبايوسيانين کان على بکتريا P.aeruginosa حيث کان معدل التثبيط 25 ملم وهذا يدل على ان البايوسيانين  فعال جدا ضد بکتريا P.aeruginosa وتليها بکتريا E.faecalisحيث کان معدل التثبيط23 ملم ومن ثم بکتريا S.typhi و E.coli حيث کان معدل التثبيط 22 ملم ويدل هذا على انها قليلة المقاومة للبايوسيانين، اما بکتريا S.aureus حيث أظهرت انها اکثر مقاومة للبايوسيانين حيث کان معدل التثبيط 21 ملم.

البادئات المخصصة (Phenazine biosynthetic operon ،Phenazine – specific methyltransferase، Flavine containing Monooxygennase)

استخدمت البادئات للتعبير عن انتاج البايوسيانين من بکتريا P.aeruginosa تبين التضاعف باستخدام تقنية PCR والترحيل الکهربائي أدى الى ظهور حزم عند وزن جزيئي لکل من البادئات المخصصة عند (Phenazine biosynthetic operon ،Phenazine – specific methyltransferase، Flavine containing Monooxygennase)

والتي تشير الى قدرة النوع البکتيري p.aergenusa على انتاج البايوسيانين وان التفسير على انتاجه يکون من خلال جينات في کروموسوم البکتريا . کما في الصورة (8-3).

صورة (8-3) تشير الى قدرة النوع البکتيري على انتاج البايوسيانين من خلال جينات في کروموسوم البکتريا

المراجــع

REFERENCES

AOAC (Association Of Official Analytical Chemises) (2002): Official method of Analysis. 4^th. ed. Assoc. Offic. Anal. Chem. Virginia. USA.

Balch, A. and Smith, R. (1994): Pseudomonas aeruginosa: Infections and Treatment. Informa Health Care. Pp. 83-84

Baron, EJ. and Finegold, SM. (1990): Baily and Scott`s Diagnostic Microbiology. 8^th ed. C.V. Mosby Co. USA.

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (2006): Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved standard. Seventh edition. Clinical and Laboratory Standard Institute Document, M7-A7, Wayne, Pennsylvania.

Collee, JG.; Fraser, GA.; Marmion, PB. and Simmons, A. (1996): Practical Medical Microbiology.4^th. Churchill Livingstone, New York.p.413-418.

Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria (1993): 3^rd Edition. Ed. G. I. Barrow and R. K. A. Feltham.Cambridge University Press, Cambridge, New York.

Cruickshank, R.; Duguid, JP.; Marmion, BP. and Swain, RH. (1975): Medical Microbiology. 12^th. New York. Churchill Livingstone.

Essar, DW.; Eberly, L.; Hadero, A. and Crawford, IP. (1990): Identifcation and Characterization of genes for second anthranilate synthase in Pseudomonas aeruginosa: interchangeability of the two anthranilate synthases and evolutionary implications. Journal of bacteriology. 172(2): 884-900.

Greenwood, D.; Finch, R.; Davey, P. and Wilcox, M. (2007): Antimicrobial chemotherapy. Oxford University Press, New York.

Hassan, H.M. and Fridovich, I. (1980): Mechanism of the antibiotic action of pyocyanine. J. Bacteriol., 141: 156-163.

Holt, J.G.; Krieg, NR.; Sneath, PH.; Staley, JT. and Williams, ST. (1994): Bergy's manual of determinative bacteriology. 9^thed. Williams, and Wilkins, USA.

Lyczak, JB.; Cannon, CL. and Pier, GB. (2000): Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbs Infect. 2: 1051-1060.

Mouget, JL.; Dakhama, A.; Lavoie, M. and de la Noue, J. (1995): Algal growth enhancement by bacteria: is consumption of photosynthetic oxygen involved.?FEMS Microbiology Ecology. 18: 35-44.

NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (2002): Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twelfth informational supplement. M100-S12, NCCLS, Pennsylvania.

Prescott, LM.; Harley, JP. and Klein, DA. (2005): Microbiology. 6^th ed. McGraw. Hill companies Inc. New York.

Saha, S.; Thavas, R. and Jayalakshmi, S. (2008): Phenazine Pigments from Pseudomonas aeruginosa and their application as antibacterial agent and food colourants. Research J.Microbiol. 3(3): 122-128.

Sotto, A.; de Boever, CM.; Fabbro-Peray, P.; Gouby, A.; Sirot, D. and Joudan, J. (2001): Risk factors for antibiotic resistant Escherichia coli isolated from hospitalized patients with Urinary Tract Infection: a Prospective study. J. Clinical Microbiol. 39: 438-444.

Todar, K. (2004): Pseudomonas and related bacteria. Todar’s Online Textbook of Bacteriology. Available online at: http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html. Accessed 5th July 2006.

Willey, JM.; Sherwood, LM.andWoolverton, CJ. (2008): Prescott, Harley and Klein’s Microbiology, 7^th Ed., McGraw-Hill Company, Inc., USA. pp.